不同马尾松品系对松材线虫的抗性选择初步研究

汤陈生，黄金水，杨 希，洪永辉，何学友

(1．福建省林业科学研究院，福建福州350012;2．福建省漳平五一国有林场，福建漳平364400)

松材线虫病在我国不断猖獗危害，新的疫点时有发生，危害树种由早期的黑松Pinus thunbergii转移到现在以马尾松P．massoniana为主(高景斌等，2005)。马尾松是我国南方主要造林树种，由于其具有耐瘠薄的生长特性，是一种非常好的生态造林先锋树种。对松材线虫病的防治方法多种多样，但往往受到人力和财力的影响，以及清理病害的困难、传播扩散途径的复杂性，很难获得较好的控制效果。松材线虫病日益威胁着我国南方地区的松树安全;另外，化学防治污染环境，带来新的次生性危害，造成更多的经济损失。尽管目前对于该病害防治仍在不断开展，但一直未取得较好控制效果，寻找更为安全、有效的防治和控制方法十分迫切。所以，探索和开辟新的防治措施是一项非常重要的事情。马尾松抗病品种的开发及运用，能够阻止或极大程度上延缓该病的发生和危害，对生态和经济发展有着十分重大的意义。国内外对松树抗松材线虫的特性已进行了不少研究(焦国尧等，1996;汪企明等，1992;王斐和申荷丽，2004;杨宝君等，1987，1993;徐福元等，1994，1998;徐福元和葛明宏，1996;Kurode and Ito，1992)，但报道结果不太一致。因此，从福建实际出发，拟通过人工接种，初步筛选出供生产上应用的抗病品系，显得尤为重要。

1 材料与方法

1．1 材料来源

1．1．1 供试马尾松 供试马尾松来源于福建省漳平五一国有林场，目前生产上推广的12个马尾松品系。这12个优良家系原产地分布在南平(A、B)2个、三明(C、D、E、G、H)5个、龙岩(K、L)2个、漳州(F)1个、泉州(I、J)2个。3年生盆栽苗的平均地径为2．678 cm，平均树高为1．486 m。

1．1．2 供试松材线虫

(1)松材线虫准备 2008年12月在厦门岛内当年松材线虫致死的枯死树样本中选取5 cm的木块，按自来水洗净→99．9%酒精液冲淋1遍→灭菌水洗3次→切碎→贝曼漏斗法分离→用螺口指形管离心的方法收集供试PWN虫株，将供试PWN虫株放在1．5%乳酸溶液中灭菌1 h后，再用灭菌水洗3次后备用。在超净工作台中将其分别接种到PDA培养基上生长良好的多毛孢菌丝中，放在恒温培养箱中，在25℃温度下初代培养。(具体的分离、培养技术详见附件1已正式发表论文)。

(2)松材线虫大量增殖 将玉米装在三角瓶中用水浸泡24h，经120℃、1．8大气压、间歇2次15 min灭菌，待冷却后接种多毛孢;在25℃温度下培养10 d后备用。从备用有松材线虫增殖的PDA培养基中，切取0．5cm×0．5 cm的培养基切块，接种在玉米培养基的菌丝上，置于25℃的恒温培养箱中，经2周后，每个三角瓶的水中有大量松材线虫，用贝曼漏斗法分离→离心→蒸溜水冲洗→贝曼漏斗收集(徐福元和葛明宏，1996)，反复收洗4～5次后，收集到大量松材线虫备用。

1．2 试验方法

1．2．1 接种方法 采用人工皮接法。用消毒解剖刀在松苗中偏下的茎干上割开树皮，深达木质部，作为接种伤口。掀开树皮，塞入大小合适的灭菌棉球;再在伤口的下方扎一塑料薄膜袋，其呈倒圆锥体，口径约7 cm，高约10 cm，袋底部及接口处用封口膜缠紧，确保不漏水;将树皮(伤口)和棉球包围其中。最后用微量移液器注入线虫悬浮液，再加入适量的无菌水，以免线虫因水分不足而死亡。对照组加入无菌水。接种后的第一天每2-3 h补充无菌水，保证24 h内袋中有水。24 h后定期浇水，并适度控制水量，避免干旱胁迫或水分过多。

1．2．2 接种测定 2009年开始对3年生马尾松盆栽苗进行第1次人工接种测定，接种量为8 000条/株，接种时间为9月10日，翌年2月将完全健康的植株全部集中，供二次接种使用。从第1次接种后病死的松苗体上分离松材线虫，经大量增殖后，于2010年5月12日进行2次接种，再从接种死亡的松苗分离线虫并扩繁，于2011年4月18日进行第3次接种，接种方法同上。接种后每天观察松苗的发病情况，统计发病级值，计算感病率、感病指数。统计接种后90 d的死亡率。

病株分级标准:0级(不感病，针叶正常)。1，2，3级(病情轻，1/3针叶褪绿发暗;病情中等，l/3-1/2针叶发暗变黄;病情较重，1/2-3/4针叶枯黄)。4级(病情严重，3/4以上针叶枯黄，濒死或死亡)(汪企明等，1997)。

感病指数=∑(各级株数×各级代表数值)/(调查总株数×发病最重级的代表数值)×100

1．2．3 生长性状测定 于2009、2010、2011年的11月分别测定各马尾松品系的地径、树高值，调查死亡率和天牛取食情况，对枯死苗木及时开展松材线虫分离鉴定，确定其死亡原因。

1．2．4 数据分析 所有数据整理与分析均采用Excel、DPS等软件进行处理(唐启义和冯明光，2002)。

2 结果与分析

2．1 马尾松抗病品系的筛选

2009-2011年以8 000条/株的接线量进行三次接种后，每天调查各马尾松品系的感病情况，根据病株分级标准，统计发病级值，计算出感病指数，90 d后统计各品系的生存率。结果(表1)显示，3次接种测定90 d后的马尾松生存率不尽相同，也没有显著的正负相关关系，但是单一从每年的接种效果还是可以看出不同品系间的抗性差异。从2009年第1次接种测定结果来看，马尾松品系 A、G、I、L 的生存率100% ＞C、J、K 的83．3% ＞B、E、F 的66．7% ＞D、H的50%，第1发病时间最早的是品系H的37 d，最迟为品系C的57 d;2010年第2次接种测定结果为，马尾松品系 A、G、I的生存率72．22% ＞L 的 66．67% ＞C、J、K 的58．82% ＞B、E、F 的56．25% ＞D、H的53．33%，第1发病时间最早的是品系H的31 d，最迟为品系G的52 d;而2011年第3次接种后，则全部表现健康，这可能与松材线虫致病力下降、或温湿度等环境胁迫因子有关。综合3次接种测定效果，可以初步判定马尾松品系A、G、I、L为抗病品系，D、H为感病品系，其它的为中抗(中感)品系。

表1 不同接种时间的马尾松接种90 d后的生存率调查Table 1 Survival rate of Pinus massoniana of different inoculation time after 90 days

对3次接种测定结果进行方差分析(表2)，结果表明3次测定效果存在极显著差异，这可能与不同接种时间松材线虫的致病力或不同龄级马尾松的抗性有关;而各品系间的测定结果存在显著差异，说明各品系对松材线虫的抗性有显著差异。

对3次接种测定结果进行Duncan多重比较，结果显示马尾松品系A、G、I、L与D、H间存在显著差异，说明马尾松品系A、G、I、L与D、H对松材线虫的抗性有显著差异。

表2 三次测定结果方差分析Table 2 The ANOVA results of three measurements

2．2 生长性状分析

对接种后的12个马尾松品系进行生长性状测定(表3)，结果表明长势最好的是品系G，长势最差的为F品系，二者间的生长性状存在极显著差异。从地径来看，马尾松品系G＞E＞J＞L＞K＞A＞D＞H＞I＞C＞B＞F，除了G与F存在极显著差异、G与C、B、F存在显著差异、G、E与B、F存在显著差异、G、E、J、L与F存在显著差异外，其余均不显著;从树高来分析，G＞L＞K＞I＞J＞E＞A＞B＞H＞D＞C＞F，马尾松品系G除与K、I、L间存在显著差异外，与其它的品系存在极显著差异，K、I、L与C、F间存在显著差异，其余均不显著，差异显著性检验结果说明了品系G的生长性状在12个品系中属于一枝独秀，表现出最优良的生长性状，B、F、C属于生长最差的一类。

对12个马尾松品系的生长性状进行方差分析，从表4的分析结果显示，不同品系间的生长性状存在极显著、显著差异，而各品系内的生长无显著差异。

表3 各马尾松品系生长性状调查(5年生)Table 3 Growth traits of different Pinus massoniana strains(5 year old)

表4 方差分析结果Table 4 The ANOVA results

用欧氏距离计算各品系之间的距离，采用离差平方和法，对12个马尾松品系的生长性状进行聚类分析，所得结果见图1。根据聚类图，取T=0．62，可将12个品系分为四类:

第一类:唯一的G，平均地径最大，平均树高最高;

第二类:I、A、D、H等4个品系，平均地径和树高生长次之;

第三类:E、J、K、L等4个品系，长势较差;

第四类:B、C、F等3个品系，长势最差。

图1 12个马尾松品系的聚类Figure 1 The cluster analysis of 12 kinds of Pinus massoniana strains

3 小结与讨论

马尾松种源对松材线虫抗性变异有明显的地理趋势。它与纬度显著负相关，与经度无关，是单一的南北向变异。同时，它与温度和降水因子显著或极显著正相关。随着产地从南至北，水热条件由湿热到干冷，抗性不断减弱。抗性弱的种源主要分布在南带。这个趋势与马尾松种源从西南至东北生长量下降的趋势基本一致，因此，对马尾松种源从抗松材线虫和生长量两个方面进行综合选择是可行的(汪企明等，1997)。

经过3个年度连续接种试验，已取得初步成效，初步筛选出4个抗病品系(A、G、I、L)，2个感病品系(D、H)，其它的为中抗(中感)品系;结合12个马尾松品系的生长性状，G、I、A、D、H等5个为生长良好品系，综合判定:A、G、I等3个品系既抗病又速生，可以进行造林试验，通过进一步测定后再进行生产上推广应用。课题组认为选择出的这些抗病品系只是获得的初级成果，对这些抗性材料还必须经过多次人工接种试验。不断淘汰感病材料，最终获得抗性稳定的抗病种源和家系，以此为亲本材料，建立抗病马尾松种子园，为林业生产和造林绿化提供抗病良种。

高景斌，蔡卫兵，徐六一，席启俊，户田忠雄．2005．接种用松材线虫分离种群的筛选．林业科技开发，19(1):24-27．

焦国尧，沈培垠，李红梅．1996．日本松材线虫和南京松材线虫对雪松和马尾松的致病性研究．植物检疫，(4):193-195．

唐启义，冯明光．2002．实用统计分析及其DPS数据处理系统．北京:科技出版社．

汪企明，吴礼才，杨宝君，胡凯基，冯沛熙，许德珏，李永忠．1992．马尾松抗松材线虫病的验证及黑松感病进程．森林病史通讯，(4):4-6．

汪企明，徐福元，葛明宏，王章荣，陈天华．1997．13年生马尾松39个种源对松材线虫抗性变异初步研究．浙江林学院学报，14(1):29-34．

王斐，申荷丽．2004．日本的抗松材线虫育种研究．世界林业研究，17(6):44-46．

徐福元，葛明宏．1996．南京地区不同松种和马尾松种源对松材线虫病的抗性及病害流行规律．林业科学研究，9(5):521-524．

徐福元，葛明宏，汪企明，张培，朱克恭，赵菊林，胥东，王敏敏．1998．马尾松种源对松材线虫病的抗性．南京林业大学学报，22(2):29-33．

徐福元，席客，徐刚，周元生，许文力，徐克勤，葛明宏．1994．不同龄级马尾松对松材线虫病抗性的探讨．南京林业大学学报，18(3):27-33．

杨宝君，胡凯基，王秋丽，孙玉林，吴政民，汪企明．1993．松树对松材线虫抗性的研究．林业科学研究，6(3):249-255．

杨宝君，王秋丽，邹卫东，李永才，于涛，王君明．1987．不同松树品种对松材线虫的抗性．植物病理学报，17(4):211-214．

Kurode K，Ito S．1992．Migration speed of pine nematodes and activities of other microbes during the development of pine-wilt disease in Pinus thunbergii．J．Jpn．For．Soc．，74(5):383-389．