微流控芯片免疫分析方法的研究进展

樊斐，张国军，康熙雄

微流控芯片技术是利用微通道精确控制和处理微尺度流体，从而在微芯片上实现进样、稀释、混合、反应、检测等多种功能，其最突出的优点是只需少量标本或生物样品，便可高效快速地完成各种微分析检测，并具有高灵敏度、高通量、低成本和设备微型化的优势[1]。近年来微流控芯片技术发展迅速，在分析领域有着广泛的应用。鉴于微流控芯片具有在微小尺度下同时完成大样本量并行操作等优势，将微流控芯片技术与免疫分析结合，是近些年新发展起来的一项技术，大大改善了传统免疫分析性能。本文将从微流控免疫分析的芯片制作、类型和多元免疫分析等多个方面介绍微流控芯片免疫分析方法的研究进展。

1 微流控芯片的制作

1.1 载体材料

微流控芯片载体的材料有很多，其中最常见的是硅、玻璃和聚合物材料。不同材料具有不同的特性，如硬度、导电性、疏水性、透光性等方面的差异，而要在微流控的平台上实现不同功能就需要利用这些不同的特性。

1.1.1 硅材料 硅材料耐高温并具有良好的导热性，结构坚固，可通过成熟的微加工方法进行形貌加工，故曾作为早期微流控芯片制作的主要材料。但由于其光学不透明和本身导电的特点，无法进行光学检测以及电渗流液体运输[2]，而且制作成本昂贵、耗时，这些不足限制了硅在微流控免疫分析中的实际应用。因此，硅更多应用于光刻中模板的制备。

1.1.2 玻璃材料 与硅相比，玻璃相对便宜，透光且不导电，很快便取代了硅的位置。然而玻璃易碎，加工手段有限，而且玻璃在湿法蚀刻过程中很难做出高深宽比的结构，虽然后续发展的干法蚀刻可得到较高深宽比的结构，但价格昂贵。

1.1.3 聚合物材料 近些年，高分子聚合物材料由于低成本、制作过程简单，被视为制作微芯片的理想材料。许多微流控应用是在聚合物基质上实现的，包括聚碳酸酯（polycarbonate，PC），聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmecrylate，PMMA）和聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）等。其中 PDMS是目前使用最为广泛的一种高聚物材料，具有化学惰性、光学透明、电绝缘性、生物兼容性好、可塑性强等优点。然而，由于表面疏水性的特点使得这一材料应用于免疫分析时受到限制，例如液体中易形成气泡、耐久性差、蛋白和小分子非特异性吸附等问题。不过，这些问题可通过表面修饰来解决。

1.2 加工方法

高聚物材料是微流控研究中常用的材料，以其为基片加工微流控芯片的方法主要有模塑法、热压法、激光刻蚀法和软光刻等，其中最常用的是模塑法和热压法。

1.2.1 模塑法 首先利用光刻和蚀刻的方法制作通道部分突起的阳模，然后在阳模上浇注液体的高分子材料，将固化后的高分子材料与阳模剥离后就得到了具有微结构的通道。这一方法简单易行，不需要高技术设备，可用于大量生产芯片。

1.2.2 热压法 具体步骤为在热压装置中将高聚物基片与阳模紧贴在一起，当基片加热到软化温度后，对阳模施加压力，可在基片上印制出相应的微结构。将阳模和基片一起冷却后脱模，就得到所需的微结构。此法比较适用于PMMA和PC等聚合物材料。热压法可实现批量复制，设备及操作相对简单，便于实现较高程度的自动化生产[3]。

2 微流控芯片上的免疫分析

免疫分析是基于抗原-抗体特异性结合的一种分析方法，具有极高灵敏度和特异性，但常规免疫分析通常需要数小时，操作过程烦琐，消耗大量试剂和样本，并且检测设备较大，难以满足现场检验的要求。与传统微孔板免疫分析相比，微流控芯片免疫分析具有以下优势：①操作简便，仪器微型化；②免疫反应在微通道中进行，比表面积大，扩散距离显著缩短，加快了抗原抗体反应，缩短了反应时间；③体积小，节约试剂和样本；④可多样本、多指标同时检测[4-5]。对常规免疫分析和微流控免疫分析进行比较（表1），不难看出微流控芯片免疫分析有很多优点，但目前仍处于基础研究及产品开发阶段。根据免疫试剂是否均相存在，可将微流控芯片免疫分析分为异相免疫分析和均相免疫分析。

表1 微流控芯片免疫分析与常规免疫分析的比较

2.1 异相微流控免疫分析

异相微流控免疫分析常采用夹心法，利用固定在固相载体表面上的抗体或抗原捕获待测抗原或抗体，其优点是能使抗原或抗体从稀溶液中富集至固相载体表面，但是需要在检测前将游离的和结合的标志物分离。

2.1.1 蛋白质固定 固定蛋白质的方法有很多种，包括直接吸附、共价化学连接和生物亲和反应。抗体等生物分子可以通过疏水作用直接吸附在疏水性微通道的表面，但是可能引起抗体的构象改变而导致活性降低。Yakovleva等[6]采用了五种不同的方法在硅片的表面固定抗体，指出抗体直接吸附在硅片表面时由于在吸附过程中构象的改变导致抗体部分或者完全变性，因此需要控制抗体结合的种类和方位。化学连接是通过将活化的蛋白位点与免疫反应基底上的特殊官能团发生化学反应，将蛋白质通过化学键连接到反应基底上。此方法比物理吸附有更好的空间取向性，也可以保存更长时间。Wang等[7]利用共聚物处理 PMMA 微通道的内表面以具有硅醇基团，实现抗体在PMMA 微管道表面的固定。此方法不仅保护了抗体的生物活性并可抵抗非特异性吸附。生物亲和反应指在表面接上生物亲和分子，再通过生物亲和分子与蛋白质反应，将蛋白质以一定取向固定到基底表面。此种方法可以提高抗原的捕获效率，最大限度地降低空间位阻，将反应位点暴露出来。Wen等[8]用生物素-聚L-赖氨酸接枝聚乙二醇（biotin- PLL-g-PEG）作为表面连接剂降低抗体和通道表面的排斥力，并通过亲和素桥将固定在抗体Fc 段的生物素化的蛋白 A 连接到生物素化的PMMA 表面，促进了抗体的连接和捕获。蛋白质的固定直接影响到分析的灵敏度和重复性，因此对于微流控芯片免疫分析系统，采用合理的方法交联抗体显得非常重要。

2.1.2 微流控芯片封闭 由于微流控芯片的高比表面积，蛋白和通道的作用加强，导致蛋白非特异性吸附增强，这些非特异结合不仅会影响分析效率，而且使背景增高。因此，可在完成目标蛋白的固定后将其他无蛋白质的区域进行封闭，以防止待测样品中的蛋白质与之结合，形成非特异性反应。封闭剂一般选用小分子化合物，最常用的有脱脂奶粉和牛血清白蛋白。

2.1.3 洗涤 通过洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，以清除残留在微通道内没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。如 PDMS 膜对蛋白质的吸附强，洗涤可把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。

2.1.4 常用检测方法 以微流控芯片为平台的各种化学反应对检测方法的要求比传统免疫检验更严格。光学检测由于简单、干扰小是目前微流控芯片研究中应用最广泛的方法，其中最常用的是荧光检测和化学发光检测法[9]。Lin等[10]在PDMS 芯片上用夹心免疫荧光法检测了人血管内皮生长因子，检出限为4 pmol/L。化学发光检测灵敏度高，无需外来光源，降低了对设备的要求，易于微型化和集成化，是一种非常好的定量分析方法，符合微流控芯片的发展趋势。Kamruzzaman等[11]将微流控芯片与化学发光检测相结合完成对 L-苯丙氨酸的测定。除此之外，还有电化学检测法等。

2.1.5 应用 Kido等[12]在微芯片上实现 ELISA 方法检测牙槽缝隙液体中的钙网蛋白。通过对临床样本的检测，与传统 ELISA 方法进行相关性分析，结果显示线性相关，r2=0.981。Haes等[13]利用具有双堰结构的微流控芯片通道来固定包被有葡萄球菌 B 型肠毒素（SEB）抗体的聚苯乙烯微珠，先与荧光标记的抗原充分反应后，再加入未标记的SEB 抗原。由于未标记的抗原与抗体的亲和力远大于标记抗原与抗体的亲和力，此时标记抗原被置换出来，检测芯片上置换出来的标记抗原的荧光信号，此信号强度与抗原浓度成正比，分析时间仅需 20 min，检测限为1 fmol/L（28.5 fg/ml）。Huang等[14]用超顺磁珠作为甲胎蛋白（AFP）抗体的固相载体，采用双抗体夹心的方法，在微流控芯片的平台上检测 AFP，分析时间仅需 20 min，检测范围为1～800 ng/ml，检测限达 0.23 ng/ml。

2.2 均相微流控免疫分析

均相免疫分析的免疫试剂和待测物在同一相中，可通过微流控芯片上不同的微通道流入免疫反应微池或反应通道，进行特异性反应。因此免去了抗体固定和洗涤步骤，也无需考虑固相载体上的非特异性吸附。但因为免疫反应形成了复合物，一般需要对混合物进行分离之后才能实现检测。通常可根据扩散特点、等电点、荧光偏振、荧光共振能量转移及酶活性的不同而区别，但最常用的是毛细管电泳分离，即利用免疫复合物与游离的抗原、抗体的电荷不同而分离[15]。然而，电泳分离效率受样品基体影响较大，有时不能有效分离。此外，只有当复合物与游离抗原、抗体电泳迁移速率明显不同时，才能使用电泳分离；如果分析物是蛋白质或大分子，抗原抗体复合物可能沉淀或形成多种复合物，也会影响分离效果。

Herr等[16]研究一种基于凝胶电泳的免疫分析微流控芯片。将样本前处理（混合、孵育和富集）和电泳免疫分析整合在一起，在10 min 内完成 20 μl的唾液中的基质金属蛋白酶 8（MMP-8）的检测。Wang等[17]采用微流控芯片电泳的方法检测牛奶和肌肉中残留的磺胺类药物，4 种磺胺类药物在1 min 内分离，检测限为0.2～2.3 μg/L，具有良好的重复性。Karns和Herr[18]还尝试使用电泳的方法分析人眼泪中的蛋白含量，来进行眼睛相关的疾病和病理学分析，发展了一种非侵入的基于眼泪的诊断技术。乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）是一种存在于眼泪中对干燥综合征有特异性的生物标志物，利用均相电泳免疫检测方法，可以在5 s 内检测乳铁蛋白的含量，仅需要检测 1 μl的眼泪。结果表明，芯片检测相对于ELISA 有更低的检测限。

3 多元免疫分析

多元免疫分析指对单个样本的多种分析物同时进行检测，不仅减少了昂贵分析样品的用量，而且极大地降低了分析成本。这种分析模式已是微型全分析系统（micro total analysis system，μTAS）新的发展方向，而且在某些领域尤其受到重视，如医学诊断、蛋白质组学等。作为多元免疫分析的平台，最常用的是表面微阵列和微珠[19]。但在多元免疫分析中几种标记物的测定条件需要相互协调，限制了测定的灵敏度。

3.1 基于表面微阵列的多元免疫分析

微阵列是将不同或相同的抗体固定在芯片通道中不同位置而形成的，一次进样能同时检测多种分析物，或同时检测多个样品。Delamarche等[20]曾经报道了一个尤为著名的方法，称为微流网络（μFNs）。先用一个 μFN 传输蛋白使其以条带的形式固定在基底的表面，并在其垂直方向上用第二个 μFN 传送分析所需要的溶液，因此，芯片上形成了马赛克型的结构，在发生反应的地方才会检测到荧光信号。大多数的多元免疫分析都是基于这种模式实现。如 Yang等[21]利用微芯片平行连续稀释检测人血浆中的人免疫缺陷病毒（HIV）抗体，实验将一片已包被 HIV 抗原的PC 膜固定在两片 PDMS 中间，其中一片 PDMS 刻有微通道，并在相应的液流汇合的管道内做了混合装置，使充分混合，另一片 PDMS 为基片，通过对流体的控制，可检测到不同稀释浓度的样本。该法可同时检测不同浓度的多种抗原或抗体，提高分析效率。

3.2 基于微珠的多元免疫分析

基于微珠多元分析的原理是通过给微珠编码，然后对微珠上的信号解码而实现。最简单的方法是将包被有抗体的微珠分隔到不同的隔间内，让样本充分与这些微珠接触反应。但芯片本身体积很小，所以可安装的隔间数量有限，而且样本量也须充足才能与所有隔间的微珠接触。用来解码微珠的方法包括光学、电学及物理方法等，而在微流控平台进行多元免疫分析最常用的方法是荧光编码。Riegger等[22]用标有荧光基团的微珠检测了两种分析物，但受到染料数量的限制。另一种解码方法是运用二维编码技术，如 Lminex 系统的xMAP，将微珠用两种颜色的染料标记，在10 种不同强度下结合，可产生 100 种识别码。

4 展望

经过近 10年的快速发展，微流控芯片免疫分析方法已经取得了喜人的成绩，该方法快速、高效、低耗、有较高的特异性和灵敏度，应用前景广阔，但仍存在一些不足，如对一些复杂的未进行预处理的样本很难进行分析，微通道内壁修饰、抗体的固定及检测的自动控制等技术还有待改进和完善，分析结果的可靠性及芯片的稳定性还需要提高，以及配套仪器的微型化等。微流控免疫分析技术是多学科的融合与运用，包括生物、化学、医学、流体、微电子、材料、微机械等，伴随着各个学科技术的不断进步与发展，这项技术有望成为生命科学最主要的分析研究手段之一。

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