固相萃取/超高效液相色谱法测定龙胆泻肝丸中栀子苷、龙胆苦苷与黄芩苷

张 勇，薛昆鹏，何 美，陈再洁，吴 虹，赵岳星

(1.安徽中医学院 药学院，安徽 合肥 230031;2.月旭材料科技(上海)有限公司，上海 201203)

龙胆泻肝丸是名方龙胆泻肝汤的一种制剂，由龙胆、栀子、黄芩、泽泻等10味药物组成，具有泻肝胆、利湿热等功效，主治肝胆实火上扰。药方中龙胆为君，栀子、黄芩为臣［1］，有效成分分别为龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷(化学结构式如图1)，其中龙胆苦苷和栀子苷均属于环烯醚萜苷类成分，其化学结构非常相近，用高效液相色谱(HPLC)进行检测时易相互干扰［2］。

目前2010版《中国药典》1部中的龙胆泻肝丸已收载了3个成分的含量测定方法［3］，然而，由于本品成分复杂，测定时不仅易产生干扰和误差，其所含的非指标性成分在采用HPLC测定时保留时间较长(全程60 min)，影响其3个成分的快速、准确测定。因而，本研究利用固相萃取(SPE)技术对本品进行预处理后采用超高效液相色谱(UPLC)法进行测定［4］，使分析时间降低至13 min，且所得峰形对称，便于保护UPLC细粒径色谱柱。该方法简便易行，可更好、更快地用于该制剂的质量控制。

图1 栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的化学结构式Fig.1 Chemical structures of geniposide，gentiopicroside and baicalin

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity H－Class UPLC超高效液相色谱仪、Empower 2色谱数据工作站(美国Waters公司)，Milli-Q超纯水制备系统(美国Millipore公司)，CP225D型电子天平(德国Sartorius公司)，KQ-200KDB超声波提取器(220 V，50 kHz)，WelchromC18E固相萃取柱(200 mg/3 mL，月旭科技公司)。

龙胆泻肝丸(水丸，规格:6 g/100粒;批号:0083081、0083082、0083083，北京同仁堂制药有限公司);龙胆苦苷对照品(110770－201013)、栀子苷对照品(110749－200714)、黄芩苷对照品(110715－201016)购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈(色谱纯，美国天地公司)。

1.2 标准溶液的配制

精密称取栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷对照品各0.80、1.07、2.05 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液。

1.3 样品前处理

取适量龙胆泻肝丸，研细，分取两份，按照如下步骤制备样品溶液。

1.3.1 样品的提取 精密称定研好的粉末1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇水溶液，盖紧瓶塞，称定重量，超声处理20 min，放冷，用50%甲醇补足重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液，得样品提取液，待净化。

1.3.2 样品的净化 依次用甲醇、超纯水和50%甲醇各5 mL活化C18固相萃取柱［5］，随后精密移取5 mL上述处理好的样品提取液加载到活化后的C18柱上，控制流速为1滴/s，弃去初滤液2.5 mL，收集后续的流出液，经0.22 μm有机微孔滤膜过滤，以备测定。

1.4 仪器条件

2 结果与讨论

2.1 色谱分离体系的优化

采用UPLC对目标物质进行快速分析，选择1.8 μm粒径的C18色谱柱，发现当选择2.1 mm×50 mm和2.1 mm×100 mm两种型号色谱柱时，栀子苷和龙胆苦苷很难分离，而选择4.6 mm×50 mm色谱柱，样品可达到基线分离，原因可能是由于中药样品基质复杂，选择太细的色谱柱，填料量过少使得样品过载而无法分离;流动相参照2010版中国药典1部及其他文献进行对比分析［2－3，6－8］，发现在甲醇－0.2%磷酸体系下，峰形拖尾严重;在乙腈－1%醋酸体系下，栀子苷和龙胆苦苷无法达到基线分离;而选用乙腈－0.1%磷酸体系时，所得峰形较好，分离度满足要求，且分析总时间相比于药典方法缩短了一半(见图2)，并且药典方法选用的流动相(0.2%磷酸溶液)pH值过低(pH＜2.0)，不适于色谱柱的长期使用。

2.2 流动相条件的优化

以不同比例的乙腈－0.1%磷酸水溶液进行初始梯度设置，发现当乙腈初始含量低于12%时，龙胆苦苷和栀子苷的保留时间均会延后，且分离度随之下降，当乙腈达5%时两峰完全重叠。而乙腈初始含量高于12%时，两峰的分离度虽然有所提高，但出峰太快，导致与前面峰难以分离，因此，选择12%乙腈－0.1%磷酸水溶液作为最佳初始流动相。

图2 3种化合物在不同分离体系下的色谱图Fig.2 Comparison of chromatograms of three compounds under different systems

2.3 样品前处理的优化

考察了直接提取和使用SPE净化两种前处理方式时目标物的分离效果。结果表明:直接提取的样品，需在11.5 min后渐进提高乙腈比例至50%，才能将黄芩苷出峰后的非指标性成分洗脱，而采用SPE净化后的样品，由于去除了大量杂质的干扰，不需要用高比例有机相进行后续杂质的洗脱，大大缩短了平行进样梯度系统平衡的时间。

2.4 SPE净化条件的优化

本实验将50%甲醇提取液直接经C18固相萃取柱进行净化，在此洗脱溶剂系统下，每隔0.5 mL收集流出液，共收集9管。以流出体积为横坐标，3个成分的吸收峰面积为纵坐标作流出曲线，结果在第6管即初滤液在2.5 mL后，流出液的栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的峰面积已达平衡，因此最终选择流出液的初滤液体积为2.5 mL。这主要是利用待测成分在样品液与C18固定相之间达成分配平衡后，流出液与样品液中所含待测成分的浓度一致，而此时样品溶液中对C18分配系数较大的成分仍保留在萃取柱中，从而达到排除干扰物质、减少分离时间和保护色谱柱的目的［9］。为考察待测组分的饱和流出曲线受洗脱溶剂极性的影响，将样品提取液的甲醇含量分别调至40%和60%进行平行洗脱，发现在40%甲醇洗脱溶剂下，10 mL内无法达到3种待测组分的流出平衡，而在60%甲醇洗脱溶剂下，柱上强保留的杂质均洗脱下来，对黄芩苷的分离产生干扰。综合考虑，选择50%甲醇作为SPE的洗脱溶剂。

2.5 流速与柱温的优化

考察了不同柱温和流速对各组分分离度的影响，结果见表1。由表1可知:流速为0.7 mL/min时，栀子苷与龙胆苦苷的分离度较好，但黄芩苷与前后峰的分离度不理想;在相同条件下流速增加到0.8 mL/min时，3种主要成分的分离度均较佳，且保留时间缩短;当流速增加到0.9 mL/min时，三者的分离度未改善，反而有所降低。柱温为20℃时，栀子苷与龙胆苦苷能得到良好分离，黄芩苷与前一个杂质峰分离较好，与其后的杂质峰分离度基本满足定量要求;柱温升至25℃时，各主要成分的分离度均大于1.5，符合要求;当柱温为30℃时，各组分的分离度均降低。综合考虑，流速选择0.8 mL/min，柱温选择25℃。

表1 3种成分在不同流速和不同柱温下的分离度Table 1 Resolutions of three compounds under different flow rates and column temperatures

2.6 方法的精密度、线性范围、检出限与定量下限

取“1.2”对照品混合标准溶液，按本方法进行分析，于同日内测定6次，连续测定5日，测得栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷峰面积的日内和日间精密度;将对照品混合溶液分别进样0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0 μL进行测定，以峰面积(Y)对标样的进样量(X，ng)进行线性回归，得到各化合物的线性回归方程;并以3倍信噪比(S/N=3)所对应的浓度为检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)对应的浓度为定量下限(LOQ)，结果见表2。从表2可看出，栀子苷在12.8～128 ng，龙胆苦苷在17.2～172 ng和黄芩苷在32.8～328 ng范围内呈良好线性，相关系数均大于0.999，日内和日间相对标准偏差均不超过1.8%。

表2 方法的精密度、线性范围、检出限及定量下限(n=6)Table 2 Precision，calibration curve，LOD and LOQ of the method(n=6)

2.7 方法的重复性、稳定性及专属性

精密称取同一批号龙胆泻肝丸1 g，按“1.3.2”方法制备6份供试品溶液进行测定，得到栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的RSD分别为1.7%、0.8%和0.7%。

重新制取一份供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12 h进行测定，3个成分的 RSD分别为0.7%、1.2%和0.9%，表明12 h内3个成分在供试品溶液中基本稳定。

按处方比例分别制取缺栀子、缺龙胆和缺黄芩的阴性样品，精密称取1 g，按照“1.3.2”方法，制备阴性样品溶液后进行测定，色谱对比图见图3。结果显示对栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的含量测定无干扰，专属性良好。

图3 混合对照品(A)、供试品(B)、缺栀子阴性样品(C)、缺龙胆阴性样品(D)、缺黄芩阴性样品(E)的UPLC色谱图Fig.3 UPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)，negative sample without Gardeniae Fructus(C)，negative sample without Gentianae Radix et Rhizoma(D)，negative sample without Scutellariae Radix(E)1.geniposide，2.gentiopicroside，3.baicalin

2.8 回收率实验

精密称取龙胆泻肝丸(批号:0083081)粉末0.5 g 6份，分别精密加入对照品混合溶液(另配，栀子苷0.82 g/L，龙胆苦苷0.64 g/L，黄芩苷2.31 g/L)1 mL，按“1.3.2”方法制备溶液后测定，计算得栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的平均回收率为99%、99%和95%，RSD分别为2.3%、1.9%和2.8%。黄芩苷回收率偏低可能是由于C18萃取柱填料对于分配系数大的组分部分吸附所致。

2.9 实际样品的测定

分别取不同批号的龙胆泻肝丸，按“1.3.2”方法处理，每批样品制备3份，用标准曲线法分别计算3批样品各成分的含量，测定结果见表3，该结果符合中国药典含量测定规定。为进一步进行方法学验证，采用现行国家药品标准的常规HPLC方法，选择岛津LC－10A液相色谱仪，Ultimate AQ－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，甲醇－0.2%磷酸梯度洗脱对3批龙胆泻肝丸样品进行检测，每个样品平行测定3次，测定结果见表3。数据显示，药典法测定结果与本法测定结果具有良好的一致性。对两种方法的检测结果进行F值和t值检验，结果显示，两种方法之间无显著性差异。此外，药典法所需分析时间为60 min，流动相的pH值小于2.0，对栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的定量下限分别为6.84、8.79、4.24 mg·L－1，相比于该方法，本实验所建立的方法分析时间更短，灵敏度更高。

表3 两种方法测定龙胆泻肝丸含量数据对比Table 3 Determination results of different experimental methods in Longdanxiegan Pill w/(mg·g－1)

3 结论

本实验建立的SPE/UPLC方法，可在较短时间内实现对龙胆泻肝丸中栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷三个指标成分的快速检测。该方法灵敏度高、重复性好，可为今后该制剂的质量控制提供理论依据。

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