生物碱样品中有效成分的CZE法分离与测定

高苏亚，王 黎，王树春，李 华

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021;2.西北大学 分析科学研究所，陕西 西安 710069)

咖啡因、茶碱、可可碱是被广泛用于食品和药品的甲基黄嘌呤类生物碱，因具有多种生理活性而倍受青睐［1］。但高剂量或长期服用易产生成瘾性，甚至会导致焦虑、头痛、失眠、心律不齐等不良反应，被国际奥林匹克协会(IOC)定位为违禁物质。由于咖啡因及黄嘌呤类化合物广泛存在于日常饮食中［2］，IOC已规定尿液中咖啡因的检测浓度不得超过12 ng·L－1［3］。因此建立对这3种结构非常相似的生物碱在实际样品中的分离和测定方法尤为必要。已有文献报道用HPLC结合紫外、安培等检测器［4－5］、TLC［6］、离子色谱［7］和 CE［8－12］检测食物和药物制剂中的黄嘌呤类生物碱，其中 HPCE 以其分离高效［13］、自动化程度高、试剂消耗量少、快速方便等特点而更具优势。但文献报道中的CE法大多仅限于其中一种或两种生物碱有效成分的测定，或是某一种样品的测定。本文以β-环糊精(β-CD)为添加剂，采用CE中最为简单的区带毛细管电泳法(CZE)分离测定了茶叶、饮料类、咖啡类和药品制剂中3种黄嘌呤类有效成分，为3种生物碱在各类实际样品中的测定提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P/ACETMMDQ型高效毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，配有二极管阵列检测器(DAD)和32Karat Software色谱工作站;熔融未涂层石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BSZ10S电子天平(德国Sartorius公司);PB-10型酸度计(德国Sartorius公司)。

咖啡因、茶碱、可可碱标准品均购自中国药品生物制品检定所。茶叶、可乐罐装饮料、雀巢咖啡购自西安市人人乐超市，复方茶碱片和复方茶碱麻黄碱片购自西安市友谊医院，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 溶液制备

标准溶液:精密称取一定量咖啡因、茶碱、可可碱对照品，分别用水配制成质量浓度均为7.20 g·L－1水溶液，于4℃冰箱保存，使用前混合并稀释至所需浓度。

供试品溶液:精密吸取10.0 mL可口可乐罐装饮料于25 mL容量瓶中，加水定容，摇匀;取约2 g茶叶或1 g雀巢咖啡，精密称定，置于100 mL烧瓶中，加入50 mL 70℃的水搅拌使其溶解，水煮30 min，冷却后过滤，反复两次，将滤液合并，精密吸取5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀待用;取20片复方茶碱片或复方茶碱麻黄碱片，精密称定，研细，取约0.5 g药品粉末，精密称定，置于烧瓶中加50 mL水超声(150 W，40 kHz)溶解30 min，精密移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容，摇匀待用。上述溶液进样前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.3 毛细管电泳条件

采用未涂层石英毛细管(75 μm ×60 cm，有效长度50 cm)，以20 mmol·L－1硼砂 －4 mmol·L－1β-CD(pH 9.0)为运行缓冲液，压力(0.5 psi)进样5 s，运行电压16 kV，检测波长273 nm，温度25℃。每次实验前分别用0.1 mol·L－1HCl、水、0.1 mol·L－1NaOH、水和缓冲液各冲洗毛细管10 min。每两次运行间分别用水和缓冲液各冲洗3 min。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

经紫外光谱扫描，咖啡因、茶碱、可可碱在273 nm附近均有最大吸收，因此选择273 nm作为本实验的检测波长。

图1 缓冲液浓度对3种生物碱迁移时间的影响Fig.1 Effect of buffer concentration on migration time of three alkaloids

2.2 缓冲液浓度的选择

选用硼砂缓冲体系，基线较平稳。本实验考察了硼砂浓度为5.0～50.0 mmol·L－1时对3种生物碱分离的影响(见图1)。结果发现，硼砂浓度较低时，咖啡因和可可碱较难分离，随着硼砂浓度的增大其分离度有所提高，但分析时间大大延长，同时电流也随之升高(当缓冲液浓度为40 mmol·L－1时，电流已接近100 μA)，同时茶碱的峰拖尾现象加重。综合考虑峰形、峰电流强度和分析时间，最终选择硼砂的最佳浓度为20 mmol·L－1。

为了进一步改善咖啡因与可可碱之间的分离度和峰形，实验考察了向硼砂溶液中加入不同浓度β-CD对分析的影响。结果发现，加入β-CD后3种生物碱的分离度得到显著改善，特别是咖啡因和可可碱明显可达到基线分离，三者的峰形也得到不同程度的改善。这可能是因为呈截顶圆锥状结构含7个葡萄糖单元的β-CD具有“内疏水、外亲水”的特征，与药物分子间通过非共价作用力相互作用，从而对待测物具有选择性匹配或选择性识别，使其分离度增大并改善峰形。但迁移时间随着β-CD浓度的增加而延长，当β-CD浓度较高时会使得焦耳热效应较为显著，从而导致基线不平和谱带展宽。因此，综合考虑后选择β-CD的最佳浓度为4 mmol·L－1。

2.3 缓冲液pH值的选择

缓冲液的pH值能够影响毛细管内壁硅羟基的解离，并影响待测物的表观电荷和电渗流，进而影响被测物的分离度。用硼酸将缓冲液pH值调至7.0～9.0，用NaOH将其pH值调至9.5～11.0，其他条件不变，对3种生物碱的混合标准品溶液进行分析。结果发现，当pH 7.0时，3种生物碱谱峰均有重叠，增大pH值时三者的分离度增大但同时迁移时间也不断增大，pH 9.0时三者可达到完全基线分离;继续增大缓冲液pH值时，分析时间明显延长，且电流明显上升，焦耳热增大，尤其是茶碱谱峰严重展宽。因此选择缓冲液的最佳pH值为9.0。

图2 优化条件下3种生物碱的电泳谱图Fig.2 Electrophoregram of three alkaloids at optimized conditions

2.4 运行电压的选择

考察了电压在5～25 kV范围内对3种生物碱分离的影响。结果发现，随着施加电压的增大，分析时间明显减少，峰强度也有所增加，但电压过高时分离度显著下降，峰电流明显增大，基线噪音变大，影响检测的灵敏度和稳定性。当电压为16 kV时，3种生物碱的分析时间、分离效果和峰电流均较为理想，因此选择运行电压为16 kV。

实验还考察了进样时间、毛细管柱温等因素对分析的影响。结果发现，进样时间为5 s(0.5 psi)，温度25℃时，3种生物碱的分离度、分析时间、峰形和峰电流均较佳。

综上所述，确定最佳CZE条件见“1.3”。在此条件下3组分的谱图见图2。

表1 3种生物碱的线性关系和检出限Table 1 Calibration relationship and detection limits(LODs)of alkaloids

2.5 线性范围与检出限

分别精密移取浓度均为0.72 g·L－1的混合标准溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL容量瓶中，定容。在上述条件下分别连续进样3次，以3种生物碱的峰面积(y)对其质量浓度(x)进行拟合，线性关系见表1。3种生物碱在0.036～0.288 g·L－1范围内线性关系良好，其检出限均不大于2.7 mg·L－1。

2.6 精密度、重现性与稳定性

将含咖啡因、茶碱和可可碱浓度均为0.144 g·L－1的标准混合溶液连续进样6次，测得3种生物碱峰面积的RSD均小于2.4%。取“1.2”的可口可乐罐装饮料供试品溶液连续进样6次，结果测得咖啡因峰面积的RSD为1.9%，随后分别间隔1、2、4、8、16、24 h进样，测得其峰面积的RSD为3.2%。说明样品在该实验条件下的重现性较好，在24 h内基本稳定。

2.7 样品加标回收实验

精密吸取3种对照品储备液适量(高、中、低含量)，分别加入到已知含量的信阳产绿茶样品中，按“1.2”方法制备供试品溶液，测得3种生物碱的回收率见表2。由表2结果可知，3种生物碱的回收率为97%～104%，RSD均小于4.0%，满足毛细管电泳对样品定量的要求。

表2 加样回收率实验结果Table 2 Results of recovery test

2.8 实际样品测定

在上述优化实验条件下，实际样品中的3种生物碱可得到较好的分离与检测(见图3)。可乐饮料、茶叶、咖啡、药品等4类实际样品中3种生物碱的测定结果见表3。

图3 实际样品的电泳谱图Fig.3 Electrophoregrams of some real samples

表3 实际样品中3种生物碱的含量测定结果Table 3 Determination results of three alkaloids in real samples

(续表3)

3 结论

本文建立了以β-CD为添加剂的CZE法对样品中咖啡因、可可碱、茶碱3种生物碱同时定量的分析方法。考察了硼砂缓冲液浓度、β-CD添加剂浓度、缓冲液pH值以及电泳电压等因素的影响，确定较优化的电泳条件为:20 mmol·L－1硼砂+4 mmol·L－1β-CD(pH 9.0)作为运行缓冲液，工作电压16 kV，进样时间5 s(0.5 psi)，检测波长273 nm，温度25℃。在该实验条件下，3种生物碱的电泳谱图峰面积与其质量浓度在0.036～0.288 g·L－1范围内呈良好线性，r≥0.998 4;精密度、重复性和稳定性良好，其峰面积的RSD均不大于3.2%，其检出限均不大于2.7 mg·L－1，加标回收率为97%～104%，方法快速简便，灵敏度高，适用面广，可用于多种样品种类(包括饮料、茶叶、咖啡和药品等)的分析。

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