蜂产品中吡咯里西啶生物碱分析方法研究进展

■ 郭伟华，周金慧，黄京平，李熠*

（作者郭伟华、周金慧、黄京平、李熠单位为中国农业科学院蜜蜂研究所 农业部蜂产品质量安全风险评估实验室（北京））

我国是世界最大的蜂产品生产国、出口国和消费国。但由于我国食品安全管理和研究起步较晚，蜂产品出口屡次遭遇技术壁垒。2002年由于蜂蜜中禁用药物氯霉素超标，造成出口主要目的国的禁运，并影响我国整个动物源农产品的出口。目前除了兽药残留及掺假外，吡咯里西啶生物碱作为蜂产品中一种新的危害因子已受到广泛关注，成为潜在的技术壁垒指标。

2009 年，阿根廷出口德国蜂蜜检测出含有吡咯里西啶生物碱，严重打击了阿根廷蜂蜜出口市场。2011年，欧盟食品安全局在对13,280份散装蜂蜜、1324份零售蜂蜜样本进行风险评估的基础上得出结论认为，吡咯里西啶生物碱可能会对常喝蜂蜜的婴儿以及儿童的健康构成影响。据国外专家估计，中国蜂蜜市场约有10%的吡咯里西啶生物碱检出水平，同时伴随着国内消费量增加，蜂产品中吡咯西啶生物碱的食用安全性风险不容忽视。因此，蜂产品中吡咯里西啶生物碱的检测分析方法将是质量安全领域研究热点。

本文针对蜂产品中的吡咯里西啶生物碱的来源性质，样品前处理方法，检测技术方法三方面进行概述。

蜂产品中吡咯里西啶生物碱的来源性质

1.蜂产品中吡咯里西啶生物碱的来源

生物碱是一类含氮碱性有机物，多数具有复杂的含氮杂环，有光学活性和显著的生理效应。吡咯里西啶生物碱（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是生物碱中毒性较强一类，其来源于植物中的次生代谢产物，在植物学范畴及地理学范畴均有广泛的分布，迄今为止，已从6000多种植物中分离发现了660种PA及其氮氧化衍生物，其中一半以上为有毒生物碱，这些植物95%以上集中于菊科、紫草科、豆科、兰科之中。研究表明，产生吡咯里西啶生物碱植物的花粉中含有高浓度的PAs和（或）其N-氧化物。吡咯里西啶生物碱可以通过蜜蜂访花时采集到花蜜和花粉而转移到蜂蜜中。而中国特有的蜜源植物如向日葵属于菊科，紫云英、苜蓿、苕子属于豆科。因此我国向日葵蜜、紫云英蜜、苜蓿蜜以及苕子蜜等具有潜在的吡咯里西啶生物碱检出可能。

2.吡咯里西啶生物碱的性质

PAs的基本结构为7-羟基-1-羟甲基6,7-双氢-5H-吡咯里西啶即千里光次碱（nec ine）（图1）。根据nec ine结构，主要有两种类型即倒千里光裂碱（retronecine）型和奥索千里光裂碱（otonecine）型，necine上的羟基被酯化，可分为单酯，开链双酯和大环双酯。necine上的N可被氧化，形成相应的N-氧化物，与PAs同时存在于植物体内。

图1 吡咯里西啶生物碱的主要结构

PAs对动物和人类有严重的毒性作用。其直接靶器官为肝脏，在体内通过代谢活化而致毒，可引起肝细胞出血性坏死、肝巨红细胞症及静脉闭塞症等，所以又称为肝毒吡咯里西啶生物碱。此外，还会引起肺脏、肾脏、神经和胚胎毒性，致突变和致癌等。调查表明，在俄罗斯、印度、阿富汗、牙买加、南非、美国等地，许多肝病的发生与服用含PAs的草药有关。分布广泛的PAs可以通过间接的食物污染如谷物、牛奶、蜂蜜或牧草的污染或者直接通过含PAs的传统草药、滋补品、茶等对人类或牲畜生命造成极大的毒害。

目前，对各种含有PAs的药物或食品的使用已引起世界上广泛的重视。WHO早在1989年就颁布了吡咯里西啶生物碱健康与安全指南。许多国家都对PAs及其N-氧化物的使用量有所规定。如德国政府规定PAs及其N-氧化物的每日摄入量不得大于0.1 μg，孕妇及哺乳期妇女禁止服用。

吡咯里西啶生物碱因其对人类潜在的危害，引起了越来越多人员对其进行定性和定量方法的研究探讨，现将国内外对其提取分离和检测方法做一简要概述。

吡咯里西啶生物碱提取与分离

1.吡咯里西啶生物碱的提取

早期文献中采用弱极性的溶剂从蜂蜜、牛奶和蛋类等基质中提取PAs，但生物碱特别是其氮氧化物是极性化合物，在非极性溶剂中如二氯甲烷中溶解度不大，提取效率低。近几年来提取一般选用极性较大的醇溶液如甲醇、乙醇等。蜂产品中一般采用水、甲醇或酸化水（如硫酸）提取。Keith betteridge等分别用甲醇和酸化水对蜂蜜进行溶解进而分析其中的PAs及其氮氧化物，结果表明，0.05 M 硫酸提取效果优于甲醇。因PAs在酸性条件下以离子形式存在，水中加入少量酸可以提高生物碱水溶性，因而酸水的提取效率高于甲醇。

PAs的N-氧化物极性较大，不利于分析，因而在提取过程中或样品纯化后将其还原成游离的PAs。通常是采用锌粉还原等方法或氧吸附树脂法。Beales提出锌粉的还原效率与时间有关，30 min～4 h最佳，过夜则还原效果不好。锌粉的加入时间也有不同，Keith betteridge等在溶解蜂蜜后加入，Kerrier等在经固相萃取分离纯化样品后加入。Kempf等分两步将PAs还原，用锌粉先将氮氧化物还原成PAs结构，再用四氢化铝锂将PAs结构还原为其necine结构进行检测分析。

2.吡咯里西啶生物碱的分离

吡咯里西啶的分离有液液萃取法，固相萃取法等。液液萃取法的缺点是PAs及其氮氧化物不能同时被分离纯化，操作过程烦琐，溶剂量耗用较大，且萃取过程中极易出现乳化现象，PAs损失较多，因而渐渐被固相萃取法所取代，常用的固相萃取柱有C8、C18柱。上述方法的缺点在于共提物较多，在色谱分析中的背景干扰大，影响检测的灵敏度和定量分析的准确度。阳离子交换柱对于生物碱的纯化，是一种更为专属的方法。它可以有效地去除干扰性杂质，对PAs及其氮氧化物均有良好的纯化效果并且不受其它共流出物的干扰。而且不同填料的SCX固相萃取柱提取分离的回收率不同，硅胶键和苯磺酸填料的萃取柱提取效果比较好。另外，洗脱液的比例也影响提取效率。Mroezek等考察了洗脱液对PAs及其氮氧化物的影响。分别用10%氨水：甲醇体积比为l:3和2:3，以及25%氨水：甲醇（ 1:8）洗脱出生物碱。结果表明10%氨水：甲醇 （1:3）洗脱效果最佳，回收率在70%以上。

蜂产品中一般采用SCX固相萃取柱净化杂质，如Caroline先将蜂蜜样品在水浴锅中均质化离心后，上清液置于预先活化的SCX柱中，氨化甲醇洗脱，回收率为87%，相对标准偏差（RSD）为4.42%。Beuerle采用不同的蜂蜜前处理方法。将蜂蜜样品液液萃取后在线固相萃取和QuEChERS法进行纯化，两种方法均得到了良好的效果。

吡咯里西啶生物碱的检测分析

吡咯里西啶生物碱检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法以及近几年发展起来的气质和液质等联用技术，核磁共振和免疫学方法等。

早期的PAs检测采用薄层色谱法和气相色谱法，薄层色谱法选用的显色剂为常用的生物碱显色剂如Dragendorf’s试剂（ 碘化铋钾试液）等。但这类试剂的专属性不强。选用气相色谱法对PAs进行定量分析时，检测器以火焰离子化检测器最常用，但由于PAs高温易分解，常需要衍生化，步骤繁琐。气相色谱法与其它分析技术联用，如质谱、红外等，已越来越多运用于PAs的分析鉴定。尤其是与质谱的联用。在前者良好分离的基础上，质谱检测，不仅可以鉴别和定量分析植物中的PAs，还可提供未知PAs的分子量及结构信息。

1.气相色谱与质谱联用法

Michael Kempf运用气质联用技术和和参数方法来对216个市售蜂蜜样品和500个蜂花粉样品进行检测分析，实验将样品经锌粉和四氢化铝锂两次还原为necin母核进行结构分析，用N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）衍生化。结果显示，19个样品检测为阳性，含量范围为0.019～0.120 μg/g，定量限0.01 ppm。此方法无需鉴定出每种吡咯里西啶的种类因而促进了PAs选择性鉴定研究。但此方法不能够检测otonecine型PAs。并且对蜂蜜和花粉的分析表明PAs含量高的蜂蜜与其对应的花粉含量之间没有明显线性关系。

利用气相色谱方法研究 PAs时存在衍生化烦琐，化合物不稳定且耗时等因素，加之PAs在紫外检测器的局限，液质联用技术在仪器，接口和数据处理设计上的先进性促使研究人员逐步探索开发适合于PAs分析的高效液相色谱质谱联用技术。

2.液相色谱与质谱串联法

Caroline T.Griffin采用液相色谱串联二级质谱（LC-MS/M S）分析了不同地区零售蜂蜜中的吡咯里西啶的种类和含量。方法呈现良好的线性关系（R2> 0.991），检测限和定量限分别为0.0134～0.0305，0.0446～0.1018 μg mL-1，回收率87%。但其标品中没有吡咯里西啶生物碱的氮氧化物标品因此测出的含量比实际要偏低。

Michael等采用HPLC-ESI-MS对蓝蓟蜂花粉中的吡咯里西啶生物碱进行分析，结果表明，蓝蓟花粉中的吡咯里西啶生物碱主要是氮氧化物型，并且为证明花粉是其对应蜂蜜中吡咯里西啶发生物碱的潜在来源提供了依据。

Beuerle通过对HRGC-EI-MS （SIM）和LC -ESI - MS/MS两种使用较多的方法进行比较，采用前一种方法时，样品用硫酸溶解，经过锌粉和四氢化铝锂两次还原，SCX提取净化，MSTFA衍生，GC - EI - SIM /MS分析。第二种方法的过程为加水溶解，加入QuECHERS盐和乙腈提取用LC -ESI - MS/MS分析。结果显示，GC - MS方法的优点是，能够检出较多的PAs,能应用到不同的样品和背景，不需要样品或相关PAs的背景资料，对标准物质的依赖低；缺点是otonecine型PAs不能被检出，PAs结构信息丢失，需要氮氧化物的还原，耗时长。LC-MS/MS优点是能够同时检测PA及其氮氧化物，可获得不同PAs的结构信息，耗时短，缺点是会丢失一部分PAs信息，定量定性依赖于标准物质。

3.其他方法

核磁共振主要用于吡咯里西啶生物碱的定性分析，免疫学分析如竞争性酶联免疫也在分析吡咯里西啶生物碱中得到应用，Bober MA等通过已被生产出来的倒千里光裂碱（retronecine）和野百合碱（monocrotaline）的抗体并采用亲和素-生物素抗体酶联免疫吸附法进行测定。

讨论

目前已报道的方法中还没有能够将自然界中所有可能存在的PAs进行分析鉴定。因此，应优化提取分离和分析条件来建立适用于多类生物碱同时分析测定的方法。

虽然色谱-质谱联用等技术在分析领域已经趋于成熟，但是其他分析方法及相关辅助技术尚有很大提高空间。国内外某些先进的前处理技术和仪器分析手段如：在线固相萃取、加速溶剂提取，基于碳纳米管的固相萃取、在线衍生化、二维液相色谱串联质谱分析法、超临界流体色谱分析法、免疫亲和色谱法等技术均有应用在农产品中生物碱分析上的报道，值得借鉴到在蜂产品的分析当中来。高效、快速、低能耗、污染少、多组分分析是未来蜂产品中吡咯里西啶检测方法发展方向。

蜂产品中的吡咯里西啶生物碱在很多国家都有检出报道。Dübecke采用LC-MS/MS方法对3917个蜂蜜样品和119个花粉样品进行分析，实验表明，66%的原蜜样品和94%的零售蜂蜜含有PAs，60%的花粉样品检测为阳性。PA类型可以用来鉴别蜂蜜中的PAs潜在来源并已在蓝蓟属植物的花粉分析中进行了验证。由于中国出口的蜂蜜种类有限，目前除了台湾的蜂蜜检出蜜源植物霍香的生物碱成分外，还没有对我国产蜂蜜中生物碱的检出报道。我国蜜源植物种类众多，亟需对蜂产品中吡咯里西啶生物碱开展全面的分析研究。