组织学切片法在三维重建大鼠海马结构中的应用价值

季达峰 孙李颖 宋佳敏 王 鸣 张 通 吕广明

（南通大学医学院人体解剖学系 南通 226001）

对生物体内部显微结构的三维重建是近年来医学形态学和组织工程学的一大热点。对细微生物结构重建并利用三维打印技术（3Dprint technology，TPT）可将生物体内的显微空间结构显示出来，其方法有影像学和组织学两种。影像学方法多用于脉管系统或骨骼的三维重建［1］而不适用于鼠脑微观结构的三维重建和显示，组织学方法可以通过特异染色和显微拍摄的方法对目标显微结构进行三维重建。目前已对大鼠海马结构进行了大体的三维重建和可视化［2］，但组织学方法因其重建耗时长且程序要求高，国内外较少通过此方法重建。

为了探索如何通过组织学方法方便、快速和准确地重建生物体内显微结构，本实验通过组织学切片、尼氏染色和显微拍摄，根据大鼠脑立体定位图谱对海马分区，利用可靠性较高的3DDOCTOR 4．0软件对大鼠海马结构进行三维可视化重建，计算出各区及侧脑室体积。

材料和方法

实验动物 健康、成年SD大鼠3只，由南通大学实验动物中心提供，雄性，体重250g，取全脑至脊髓颈1节段后固定。

大鼠脑冠状及矢状面切片 SD大鼠2只，取脑干标本在德国Leica冰冻切片机上行冠状面冰冻连续切片，片厚30μm，进行直接贴片，每张玻片贴6张切片，每只大鼠共获得连续切片269张，切得每只大鼠脑标本8 070μm。1只大鼠全脑行正中矢状面切片，片厚30μm。

尼氏染色、显微拍摄和图像处理 氯仿浸泡30 min，70%、95%、100%酒精各处理1min，蒸馏水洗涤30s，焦油紫浸泡10min，70%酒精处理1min，蒸馏水洗涤30s，二甲苯处理10min，中性树脂封片。

切片排列后在正置显微镜下用5倍物镜进行拍摄，依据脑片大小分为4～5个视野不等。所得照片在Photoshop 7．0软件中进行拼接处理，并统一大小为3 000×3 000像素，正中矢状切片也以尼氏染色后在5倍光镜下显微拍摄，所得照片进行拼接后大小为3 000×3 000像素。

三轴法［3］是基于物体三维特性而衍生出的对齐方法，在冠状面切片时标本的冠状面均已对齐。取半只大脑标本，在矢状面上可以利用切面对齐（图1A），再利用正中矢状切面的高低点对应算出每张切片所要上下移动的距离作为水平面对齐的标准。

三维重建和可视化 所得图像排序和对齐完成后导入3D－DOCTOR 4．0软件［4］中，根据大鼠脑立体定位图谱，以手工方式将切片中海马划分为CA1、CA2、CA3和DG 4区，并标记出侧脑室位置（图1B），然后用简单渲染和复杂渲染分别对重建模型进行渲染，利用软件自带工具对不同目标结构的表面积、体积进行计算。渲染结果以bmp文件格式保存图像，三维模型以3ds文件输出，以便导入3DMAX 8．0软件中进行对称化处理和进一步渲染。

结 果

经3DMAX 8．0软件渲染后大鼠海马结构整体、海马内细胞及侧脑室三维可视化结果如图2海马内各区的重建及三维可视化结果如图3。

图1 所得照片以三轴法对齐并根据大鼠脑立体定位图谱进行定位分区Fig 1 Photographs aligned via three－axes locating system and districted according to stereoscopic atlas of rat brain

图2 海马体，细胞带，侧脑室以及整体的各面观Fig 2 Different aspects of lateral ventricles and the body and cells of hippocampus

图3 大鼠海马结构各分区的三维重建Fig 3 3Dreconstruction of four parts of hippocampus

大鼠侧脑室、海马结构及其各区（CA1、CA2、CA3、DG、cell）的位置、体积及表面积 简单渲染和复杂渲染下海马各区体积最大的均为CA1区，其次为DG区，最小为CA2区；中心最外为CA2区，最内为DG区（表12 各区占海马整体百分比最大的为CA1区，最小为CA2区，相加后简单渲染总数为70．99% 复杂渲染总数为72．36% 表3)。

表1 大鼠侧脑室、海马结构及其各区的体积、表面积及位置Tab 1 Volume，area and location of lateral ventricle and hippocampus

表2 大鼠侧脑室、海马结构及其各区的体积、表面积及位置Tab 2 Volume，area and location of lateral ventricle and hippocampus

表3 大鼠海马结构中各区占海马总体积的比例Tab 3 The proportions of four parts （%）

讨 论

近年来随着医疗事业的不断进步，对阿尔茨海默病［5－6］（Alzheimer disease，AD）病因的研究逐渐深入，我们发现脑内海马结构的病变与AD的发生有密切关系，对脑内海马结构的研究也逐渐成为热点。

海马是齿状回外侧、侧脑室下角底壁上的弓状隆起，与齿状回构成海马结构［7］。依据细胞形态及皮质发育的差异，海马被分为CA1、CA2、CA3及DG4个扇形区。海马结构参与海马回路的构成，该环路与情感、学习和记忆等高级神经活动有关［8］。

目前对海马结构的研究已深入到内部细胞类型［9］和 CA1a、CA1b、CA1c等亚结构［2］。但对于大鼠海马的空间结构及各亚区的位置关系了解甚少，三维重建和可视化技术［2］可以对目标内部结构做全面的了解，并在电脑上生动直观地显像，某些三维软件还可以对这些结构进行量化测量。因而利用该技术对组织结构进行可视化的实验已经广泛开展，但在采集二维图像等具体方法的选用上不尽相同。目前最常用的是影像学技术，如螺旋CT［10］、DSA、MRI［11］（主要用于血管病变的三维重建以确定血管病变的部位和大小）等，这些方法较为快捷方便。

本课题组在三维重建和可视化方面做过深入的研究［12－13］，对组织学方法进行三维重建和可视化的实验步骤和方法比较了解。考虑到标本分部切片时中间过渡组织会有磨损，本实验采用全脑冰冻后连续切片和直接贴片，尼氏染色［14］后在光学显微镜下直接对切片摄片，通过Photoshop 7．0对照片进行拼接并以三轴法配准。染色采用神经系统最常用的尼氏染色法，其染色方法成熟，灰白质区分能力强，可大批量染色。通过计算机图形软件处理，参照大鼠脑立体定位图谱对照片中的海马进行分区。3DDOCTOR是一款常用的医学三维重建软件，重建方法简单，结果可靠，并带有测算面积和体积的工具。

本实验利用3D－DOCTOR4．0软件手动勾勒出海马整体以及各区的边界，重建出大鼠海马整体及各区结构，在不同的渲染条件下利用软件自带计算工具计算出各分区及侧脑室的体积、表面积，再计算出各区占海马整体的百分比［2］。在重建后的体积百分比计算中我们也发现各区百分比相加后在70%至73%之间，一方面是由于在勾勒各区边界时有些区域被忽略，另一方面由于渲染时会对勾勒区进行网格光滑而“磨损”掉一些区域。但随着渲染的复杂度提高，“磨损”区的比例会逐步下降，所以在复杂渲染中各区相加的百分比略高于简单渲染的结果。

本研究结果表明，利用组织学方法可以对大鼠脑内海马结构及其各区进行三维可视化重建；利用3D－DOCTOR4．0软件可以对重建的海马各区计算体积。

［1］ Macin D，Tomasz D，Witold G．The role of MRI and spiral CT with 3D renconstruction techniques in the temperal bone tumor surgical treatment［J］．Int Con Series，2003，1240：1443－1448．

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［5］ 王海红，肖世富．阿尔茨海默病神经病理标志物的研究进展［J］．上海精神医学，2009，21（1）：55－57．

［6］ 代玉桥，金道忠，雷德亮．小胶质细胞与早老性痴呆症脑内炎症［J］．生命科学，2007，19（1）：47－50．

［7］ Eyre MD， Freund TF， Gulyas AI．Quantitative ultrastructural differences between local and medial septal GABAergic axon terminals in the rathippocampus［J］．Neuroscience，2007，149（3）：537－548．

［8］ 高维娟，薛景凤．大鼠脑缺血再灌注损伤对海马组织中学习记忆相关的胆碱乙酰基转移酶活力变化的影响［J］．中国临床康复，2005，9（24）：242－243．

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［11］ 张海军，林志国，王跃华．中国人脑 MRI立体定向活体尾状核数字化的三维重建［J］．中国组织工程研究与临床康复，2009，13（9）：1637－1639．

［12］ 季达峰，韩笑，吕广明．三维动画技术在人体解剖学教学中的应用［J］．四川解剖学杂志，2011，19（4）：61－62．

［13］ 吴辉群，严培培，耿兴云，等．基于 Mimics软件虚拟人膝关节三维图像融合实验［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15（48）：8943－8946．

［14］ 陈志勇，杜天明，陈善成．人参皂甙Rg1对海马电损伤大鼠的学习记忆功能和海马神经细胞形态的影响［J］．南方医科大学学报，2011，31（6）：1039－1042．