云南白药对豚鼠缺血心肌的保护作用

刘歆阳 王智超 李晓丹 陆 烨 严钰锋

（1复旦大学基础医学院07级临床医学八年制1班，医学实验教学中心 上海 200032）

随着生活质量和医疗条件的改善，人类寿命逐渐延长，而老年疾病尤其是心血管病的病死率和死亡率也呈上升趋势。根据我国流行病学调查，冠心病和脑卒中发病率与死亡率在增加，平均每年以5%的速度递增［1］。在心血管疾病中，缺血性心肌病，包括粥样硬化所导致的冠状动脉狭窄或梗阻，占有相当大的比重，严重危害人群健康。

缺血性心肌病是中老年常见多发的后天性心脏病。舌下含服硝酸甘油可有效扩张冠状动脉，缓解心肌缺血性损伤，可作为急救药品对家庭突发性缺血性心脏病有良好的保护作用。然而，对于没有心血管疾病家族史的家庭，很少有储备硝酸甘油。

云南白药至今已有近百年历史，其凭借良好的止血、活血化瘀、抗炎等作用被广泛应用于内科、外科、妇科、儿科、五官科、皮肤科等多种疾病的治疗［2］，为我国多数家庭常备药。已有研究表明云南白药的主要成分三七有改善心肌缺血的作用［3］，但云南白药对心肌缺血的保护作用目前尚无报道。本实验研究云南白药对心肌缺血的保护作用，探究云南白药能否为家庭中突发性缺血性心脏病患者提供一种急救措施。

本研究应用垂体后叶素复制豚鼠急性心肌缺血动物模型［4］，以硝酸甘油干预为阳性对照，以生理盐水干预为阴性对照，通过比较心电图改变、对比组织学改变和亚细胞结构改变、对比大体缺血面积等方法研究云南白药对心肌缺血的保护作用。

材料和方法

实验材料

试剂与仪器 豚鼠手术台、哺乳动物手术器械、豚鼠用心电图生物转换器、生物信号记录仪、伊文氏蓝（复旦大学基础医学院功能学实验室提供）；垂体后叶素、硝酸甘油（上海市第一生化制品有限公司）；云南白药（云南省云南白药有限公司）。

实验动物 清洁级豚鼠30只，雌雄不限，体质量（400±30）g，由复旦大学实验动物中心提供。随机分为5组，每组6只，分别是N组（正常组，生理盐水对照）、ADH组（垂体后叶素腹腔注射造模）、NO组（造模后经硝酸甘油解救）、LD组（造模后经低浓度云南白解救）和HD组（造模后经高浓度云南白药解救）。

实验方法

模型建立与给药剂量 豚鼠急性心肌缺血模型用腹腔注射0．5U／kg垂体后叶素建立。在心电图出现心肌缺血表现后立即给予药物解救。硝酸甘油和低浓度云南白药给药剂量由成人用药量换算得到（以成人用药量分别为5μg／kg，成人平均体质量60 kg，人与豚鼠转换系数5．55计算），分别为27．75 μg／kg和3．6mg／kg。高浓度云南白药给药量为36 mg／kg。两种药物均溶于生理盐水，每只动物注射总量为0．5mL。

苏木精－伊红切片染色 解救成功后即处死豚鼠，取出心脏。豚鼠心肌组织经常规10%甲醛溶液固定，制成石蜡切片，苏木精－伊红染色后光镜观察。光镜照片为同一视野下的400倍图像。心肌染色组织切片由复旦大学基础医学院病理学系协助制作。

心电图分析 在注射垂体后叶素完成后开始计时，心电图在1min内每15s记录1次，1～5min之间，每30s记录1次。记录急性心肌缺血发生时间和持续长短。正常豚鼠的ST段大多位于等电位线上，T波均为正向［5］，急性心肌缺血时心电图形态的改变主要为ST段上移和T波高耸。急性心肌缺血心电图出现时间和持续的长短都是评价急性心肌缺血模型建立成功与否和药物干预是否有效的特征性指标［6］。起效时间定义为从注射硝酸甘油或云南白药到心电图恢复正常的时间。

心肌梗死面积计算 心电图记录完毕后立即处死豚鼠，去除心房组织及脂肪，将左心室心肌横切4～5片，对心肌行TTC（伊文氏蓝）染色，将心肌放入含有10g／L TTC的PBS（pH7．4）溶液中孵育10min。TTC染色区（深蓝色）示仍存活的心肌组织，非TTC染色区（灰白色）即梗死区。拍照后将图片由专人打乱编号，由另一位不知编号代表组别的分析人员勾画染色区与非染色区以避免期望偏倚，用图像分析软件Photoshop可计算梗死区域所占面积百分比。

结 果

豚鼠心电图分析 各组豚鼠心电图表现见图1ADH组豚鼠注射垂体后叶素后，心电图出现T波抬高的心肌缺血表现，而N组无改变，提示造模成功。注入解救药物后，NO组心肌缺血症状明显缓解，T波回复正常，平均起效时间为（13．0±6．2）s。云南白药解救组亦有解救效果，T波回复正常历时较长，低剂量组平均起效时间为（81．3±13．9s高剂量组平均起效时间为（46．0±14．0）s。差异均有统计学意义（P＜0．05，图2），提示云南白药对急性心肌缺血具有解救作用且解救作用与剂量浓度正相关，但作用时间较硝酸甘油更长。

图1 各组心电图表现Fig 1 ECG of each group

图2 NO组、LD组、HD组对ADH的解救时间Fig 2 Resuce time for ADH of NO，LD and HD groups

豚鼠心肌梗死面积分析 各组平均值、方差及组间显著性差异的检验见图3。N组与ADH组差异显著表明急性心肌缺血模型建立成功，ADH组与NO组差异显著提示硝酸甘油缓解心肌缺血效果明显。ADH组与LD组及ADH组与HD组差异均有统计学意义（P＜0．05），表明低剂量和高剂量云南白药都能减少心肌梗死面积。NO组与LD组差异显著表明LD组解救效果不及硝酸甘油，而NO组与LD组没有显著差异，则无证据表明硝酸甘油解救效果优于高剂量云南白药。TTC染色如图4所示，灰白色即梗死区。

图3 各组心肌缺血面积Fig 3 Ischemic area of each group

豚鼠心肌组织切片形态分析 N组：镜下示心肌细胞呈短柱状，彼此平行排列，核1～2个，卵圆形，居中；横纹不明显。ADH组：心肌纤维出现明显肿胀，肌纤维排列稍显紊乱并伴间质水肿。部分区域心肌细胞肿胀，细胞核碎裂，有炎性细胞浸润。NO组：心肌细胞形态基本正常，排列较为规则，几乎接近正常组织。LD组：心肌细胞水肿明显，有少量坏死细胞与炎症细胞浸润。HD组：心肌细胞水肿略有改善，坏死细胞较少（图5）。

图4 TTC染色显示缺血区域Fig 4 Ischemic Area After TTC Treatment

图5 各组心肌光镜图Fig 5 Micrographs of myocardia in each group

讨 论

急性心肌缺血模型评价 经注射垂体后叶素建模后，心电图在短时间内显示为T波抬高；心肌组织出现明显肿胀，排列紊乱伴间质水肿的现象，同时心肌梗死面积比率显著增大，与其他各组差异较大。功能学和形态学的指标与心肌缺血时的病理状态相吻合，提示心肌缺血模型建立成功。

阳性对照效果评价 NO组的心肌缺血型心电图在短时间内缓解，且组织形态学上显示心肌细胞形态和排列与N组相似，与ADH组差异较大，提示硝酸甘油对于急性心肌缺血的解救效果明显。

硝酸甘油为临床急性心肌缺血解救的常用药，其疗效得到了理论和实践的长期印证，效果显著，本实验中应用硝酸甘油对于急性心肌缺血解救的效果作为阳性对照，评价云南白药的解救作用。

云南白药对急性心肌缺血的保护作用 通过LD组、HD组和ADH组的比较，功能学和形态学的指标都提示云南白药对于急性心肌缺血有潜在的解救作用。HD组的解救作用在起效快慢、保护作用大小方面都明显优于LD组，提示云南白药对于急性心肌缺血的解救作用有一定的剂效正相关。LD组和HD组的解救效果都低于阳性对照，说明云南白药在这两个浓度的解救效果都弱于硝酸甘油。

本实验采用的给药方式是腹腔注射，与云南白药常用的口服和外用方式不同。但在医学动物实验中，只要给药剂量换算正确，不同的给药方式在效果方面是等效的。本实验以豚鼠为对象，且心肌缺血过程变化迅速，另外实验中需监测豚鼠的心电图，静脉注射、口服或外用存在需要移动体位，吸收较慢，创伤性操作，操作复杂等缺点，对心电图干扰较大，会影响实验结果的判断。而腹腔注射能够快速微创伤性给药，无需移动豚鼠体位，药物起效快。有文献证实［5，7］，针对豚鼠为实验对象的研究包括药理学、药效学、心血管疾病治疗方面的研究，多采用腹腔注射的给药途径，并能够得到公认。所以，本实验腹腔注射得到的结论是可信的。

本实验中云南白药选用了高低两个剂量，其中低剂量由成人正常剂量换算得到。目前对于云南白药的不良反应及剂量报道较少，有报道称高剂量口服云南白药会导致房室传导阻滞，但仅为少数病例［8］，缺少对其他各种影响因素的全面分析，机制阐述不清。由于云南白药没有公认的治疗窗，高剂量粗略定为低剂量的10倍，旨在研究云南白药对心肌缺血的保护作用是否有剂量依赖关系及超大剂量云南白药是否有明显的毒性作用。实验结果表明，10倍剂量的云南白药给药后短期内未发现明显不良反应。云南白药治疗心肌缺血的最佳浓度及安全的治疗窗有待于进一步设计浓度梯度实验探究。

云南白药解救心肌缺血的作用机制目前还不明确，有动物实验表明云南白药能增加心肌营养性血流［9］。临床研究发现在非血运重建急性Q波心肌梗死伴有室壁瘤的患者中，云南白药可降低患者血清白介素－6、白介素－8和高敏C反应蛋白等炎性介质的水平［10］。另外，云南白药的主要成分三七中的三七总皂苷有抗血栓形成、改善微循环、降低心肌耗氧量和减轻再灌注损伤等功能［3］。但云南白药中各种有效成分如何相互作用、是否协同对抗心肌缺血等问题还有待进一步研究。

致谢 复旦大学基础医学院病理学系张志刚老师以及功能学教学实验室的各位老师在整个项目的进展过程中给予了帮助与支持。

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［6］ 王飞宇．冠状动脉供血不足心电图的几种表现［J］．中外医疗，2011，30（2）：188．

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