桑树泛素延伸蛋白基因的原核表达

周晓慧，戴 斌，王 韡，陆小平

(苏州大学金螳螂建筑与城市环境学院，江苏苏州215123)

泛素延伸蛋白(UEP)也称泛素羧端延伸蛋白(CEP)，是氨端一个泛素分子和羧端一个核糖体蛋白(RLP)分子的融合蛋白。UEP基因转录和翻译后的产物为前体蛋白，将在脱泛素酶(DUB)作用下形成泛素和核糖体蛋白［1］。真核生物中的泛素延伸基因分为两类:一类C末端与52或53个氨基酸的蛋白质融合，这类融合的蛋白与核糖体L40(ribosomal L40)有很高的同源性;另一类与76～80个氨基酸的蛋白质融合，这类融合的蛋白质与核糖体S27a蛋白(ribosomal S27a)有很高的同源性。

泛素延伸蛋白的研究最早是在酵母中［2］，后在人类、线虫、拟南芥和水稻等物种中均克隆出编码该类蛋白的基因［3-4］。目前，国内外泛素延伸蛋白的研究主要集中在人、动物、昆虫等领域［5］，如小菜蛾［6］、烟叶蛾［7］、甜菜夜蛾［8］泛素延伸蛋白基因克隆与表达的研究，而在植物中有关泛素延伸蛋白基因的研究很少。尤其是该基因在植物生物学功能中的调控作用及其作用机理还不清楚［9-10］。陆月赏等［11］利用实时荧光定量PCR对玉米泛素延伸蛋白基因(ZmERD16)的组织表达特异性和在不同胁迫条件下的表达谱进行了分析，认为ZmERD16可能参与玉米的多种胁迫信号传导和逆境应答。目前，对木本植物泛素体系的研究尚处于起步阶段［12］。在前期的工作中，利用3'RACE技术，从丰驰桑幼叶的总RNA中反转录并扩增出植物泛素延伸蛋白基因cDNA［10］。本研究对前期克隆的桑树泛素延伸蛋白基因进行了生物信息学及原核表达分析，为进一步探讨桑树的逆境生理机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体

pGEM-T/Ube质粒(含有泛素延伸蛋白基因)、表达菌株E.coli BL 21、表达载体pGEX-4T-1均为植物栽培与生理实验室保存。pGEM-T/Ube质粒、pGEX-4T-1经Bam HI和Eco RI双酶切后，分别回收目的片段，用 T4 DNA连接酶14℃连接过夜，取10μL转化E.coli BL21感受态细胞，筛选转化子送交至上海捷瑞生物有限公司鉴定和测序后保存。

1.2 主要实验试剂

LB液体培养基、Tris缓冲液、过硫酸铵(AP)、考马斯亮蓝、氨苄青霉素(Amp)、Bam HI/Eco RI均购自上海捷瑞生物工程有限公司，IPTG购自Novagen公司。

1.3 菌体培养

取3 mL LB液体培养基加Amp至质量浓度为50μg/mL，加入经鉴定含有阳性pGEX-4T-1的质粒菌，在200 r/min、37℃条件下恒温振荡培养过夜。次日按1%比例在新鲜培养基中加入200μL活化菌液接种到LB/Amp培养基进行诱导。

当菌液浓度OD600值约为0.5时加入诱导剂IPTG使其终浓度为1.0 mmol/L进行表达诱导。在不同时间段对样品进行取样，于4℃冰箱中保存备用。

1.4 样品处理及SDS-PAGE电泳

［13］操作。

2 结果与分析

2.1 重组质粒鉴定

抽取阳性转化子质粒，并用Ba m HI和Eco RI双酶切，酶切结果如图1所示，双酶切后出现大小在500 bp左右的片段，与测序结果一致。对重组质粒进行测序，结果表明:目的片段大小为471 bp，上游有一个起始密码子ATG，下游有一个终止密码子TAG，两者之间是一个完整的开放阅读框(ORF)，编码156个氨基酸。说明重组质粒载体中含有桑树泛素延伸蛋白基因片段，表达载体构建正确。

2.2 基因产物的生物信息学分析

根据所获基因推演的蛋白序列可知，该蛋白的推测pI值是5.14，相对分子质量为17 800。卷曲螺旋是控制蛋白质寡聚化的元件，通过网站http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/COILS_form_parser对卷取区进行预测。结果如图2所示:在第10～40个氨基酸区域有存在卷曲螺旋结构的可能。

图1 重组质粒的鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid

图2 重组质粒卷曲螺旋结构预测Fig.2 Prediction of coiled-coil structure of recombinant plasmid

2.3 不同诱导时间对目的蛋白表达的影响

在37℃，200 r/min条件下，经浓度1.0 mmol/L IPTG诱导不同时间桑树泛素延伸蛋白基因蛋白的表达量。结果如图4中箭头所示:表明经IPTG诱导0～6 h内泛素延伸蛋白表达量随时间延长表达量明显增加，6 h时表达量没有明显变化。未经IPTG诱导的BL 21(pGEX-4T-1)只能看到非常浅的条带，这与生物信息预测结果一致，说明目的基因能够在宿主细胞中诱导表达。

图3 桑树泛素延伸蛋白跨膜结构Fig.3 Transmembrane structure of ubiquitin extension protein in mulberry

图4 桑树泛素延伸蛋白基因转化BL 21不同时间诱导表达Fig.4 Inducible expression of mulberry ubiquitin extension protein gene transforming BL 21 at different time

3 结论

通过本实验表明，桑树泛素延伸蛋白基因与其他植物具有较高的同源性［5］，这使得今后利用模式植物研究其功能及分子进化分析更加高效。此外，该基因能够在原核细胞大肠杆菌中正确表达，37℃条件下，经1.0 mmol/L的 IPTG诱导后，在相对分子质量为40 000前后有明显的条带出现，这与预测结果(目的蛋白相对分子质量17 800和pGEX-4T中的GST蛋白相对分子质量26 000的融合产物)一致，蛋白表达量随时间的推移显著增加。刘嘉琦等［13］只对不同温度及不同载体对泛素延伸蛋白的表达影响进行了研究，结果表明，在30℃条件下0.5 mmol/L的IPTG诱导8 h表达量最高。由于本实验仅在不同时间对目的基因原核表达影响进行了研究，经1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h后，在相对分子质量40 000前后有明显条带，但尚未因温度、诱导剂浓度等不同条件对原核表达影响进行研究。目前对泛素延伸蛋白基因表达机理尚不清楚，还需要进一步的实验研究。

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