分子印迹阻抗型沙丁胺醇电化学传感器的研究

郭春晖,杨莹莹,刘蒙,苏文豪,刘平,徐玮,张修华,王升富

(湖北大学化学化工学院,湖北 武汉 430062)

0 引言

沙丁胺醇(SAL)是一种使用广泛的β-兴奋剂,常用于治疗喘息型支气管炎、支气管哮喘、肺气肿所致的支气管痉挛[1-2].因其会残留聚集在动物可食用组织中,食用含沙丁胺醇的肉将会对人的肝、肾等内脏器官产生毒副作用[3-4].目前已报道的沙丁胺醇的检测方法有:毛细管电泳法[5-6]、比色法[7-8]、分光光度法[9-10]、免疫测定法[11-12]、结合反向流动注射微流控的安培法[13]、荧光光谱法和电致化学发光法[14-15].然而,这些方法大多都存在费时、灵敏度低、高成本和复杂的预处理过程等不足.

分子印迹技术是近年兴起的具有高度识别性和选择性材料的新技术.由于分子印迹聚合物能够高效地从复杂样品中分离富集目标分子,清除基体干扰,从而降低检出限,提高分析的精度和准确性,在传感器研究中备受关注.本文中采用电化学聚合方法,成功制备了沙丁胺醇印迹的聚对氨基苯硫酚/纳米金电化学传感器.带负电的金纳米粒子和带正电且有巯基的功能单体的使用,使该分子印迹聚合物更紧密的覆着在电极表面.该印迹电极选择性良好,可用于猪饲料中沙丁胺醇的定量检测.

1 实验部分

1.1仪器与试剂电化学工作站CHI 660C(上海辰华仪器公司,中国上海);三电极系统:裸玻碳电极(GCE直径为3 mm)或经修饰的玻碳电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,铂电极为对电极;超声波清洗仪(BRANSON2000,美国);320-S酸度计(METTLER-TOLEDO,瑞士);扫描电子显微镜(JSM-5510 LV,日本).

对氨基苯硫酚(ATP)购自阿拉丁化学试剂有限公司,沙丁胺醇(SAL)、克伦特罗和特布他林均购自中国药品生物制品研究所,氯金酸(HAuCl4)和柠檬酸三钠购自美国sigma公司.其他试剂均为分析纯.实验用水为去离子水.

1.2纳米金的制备金纳米粒子(AuNPs)参照文献[16-17]以柠檬酸三钠还原法合成.制备过程如下:所有玻璃器皿均先用王水(浓HCl+浓HNO3,V/V=3∶1)清洗干净,然后用二次水冲洗,最后置于烘箱里面烘干待用.向250 mL圆底烧瓶中加入100 mL 0.01% HAuCl4水溶液,加热至沸腾并剧烈搅拌,接着迅速加入3.0 mL 1%柠檬酸三钠溶液.上述溶液在20 s内迅速变为深蓝色,然后在60 s后最终变成酒红色.待溶液加热沸腾40 min后停止加热,继续搅拌至胶体金溶液冷却为室温.制得的纳米金平均粒径为20～30 nm,溶液置于深色容器中4 ℃低温保存.

1.3分子印迹传感膜的制备玻碳电极(φ=3 mm)经0.05 μm的α-Al2O3抛光布上抛光成镜面,依次用二次水、乙醇、二次水充分超声震荡清洗.取30 μL制备好的纳米金胶溶液滴涂于处理后的洁净GCE上,在空气中放置4 h,得到AuNPs/GCE.然后将AuNPs/GCE置于含0.1 mmol/L ATP和0.5 mmol/L SAL的HAc-NaAc(ABS,pH 5.2)水溶液中,于-0.2～+0.6 V电位范围内,0.05 V/s扫速下循环扫描20圈,即制备得到嵌入SAL的PATP/AuNPs膜电极(SAL-PATP/AuNPs/GCE).电聚合完成后,将所得电极置于0.1 mol/L盐酸-乙醇(1∶1,V∶V)混合溶液中洗涤至模板分子完全被除掉,得到保留有SAL构型空穴的PATP/AuNPs分子印迹膜电极(imprinted PATP/AuNPs/GCE).在同样的实验条件下,底液中不加模板SAL分子,制备非印迹膜电极(non-imprinted PATP/AuNPs/GCE)作比较.

2 结果与讨论

2.1 分子印迹膜电极的表征

2.1.1 分子印迹膜电极的表面形貌表征 图1是纳米金修饰电极(AuNPs/GCE)、印迹电极(SAL-PATP/AuNPs/GCE)和非印迹电极(non-imprinted PATP/AuNPs/GCE)的扫描电镜表征图.如图1(a)所示,金纳米粒子均匀地分布在玻碳电极表面,粒径约为30～50 nm.经过电聚合过程后的印迹电极SAL-PATP/AuNPs/GCE(图1(b)),金纳米粒子明显被一层膜所覆盖,仍有少量显露在膜外面,这说明沙丁胺醇印迹的聚合物层成功地连接到了AuNPs/GCE上.相反地,非印迹电极表面(图1(c)),AuNPs几乎完全被聚合物膜覆盖了.这是聚合过程中,相对于分子印迹膜电极,非印迹膜的聚合过程没有模板分子阻碍聚合物链的增长,其聚合度相对较大,聚合膜相对较厚、较紧致[19]的原因.

2.1.2 分子印迹膜电极的电化学表征 以铁氰化钾为电化学探针,采用循环伏安法对印迹电极的印迹过程进行表征,结果如图2,裸玻碳电极在铁氰化钾溶液中出现一对可逆的氧化还原峰(图2(a)),而对于纳米金修饰电极(图2(b)),峰电流有了显著增强,这是因为电极表面修饰了金纳米粒子以后,其比表面积大大增加.对于印迹电极(图2(c)),由于聚合生成的膜比较平整,阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的氧化还原反应,故峰电流较小.从图2(d)可以看出,非印迹电极的响应电流最小,这可能是由于非印迹聚合膜相对于印迹膜而言更紧致、更厚,因此成为探针分子[Fe(CN)6]3-/4-向电极表面扩散的阻碍.

图1 (a)AuNPs/GCE,(b)SAL-PATP/AuNPs/GCE,(c)non-imprinted PATP/AuNPs/GCE的扫描电镜图

电化学交流阻抗技术是研究电极过程动力学及界面现象的重要手段.在交流阻抗图谱中,高频和低频两个区域可用来描述电极表面法拉第阻抗的变化.其中,直线状的低频区域对应于扩散过程,而我们更感兴趣的频区是半圆形的高频区域,此区域电极反应对应于纯动力学控制,相应的异相电子传递电阻因为电极表面的阻碍作用而变大,半圆的直径等于与电极/电解质界面绝缘性有关的电子传质电阻.

图3为不同修饰电极在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗图.由图3可知,未洗脱的印迹电极(图3(a))的半圆相对较大(Rct约为12 000 Ω).而洗脱模板分子之后,电极的Rct(约为4 000 Ω)值急剧减小(图3(b)),说明印迹孔穴已经形成.当imprinted PATP/AuNPs/GCE在SAL溶液中培养一定时间后,Rct值又增大(c),说明印迹空穴与模板分子相互作用[18],一定量的SAL填补了imprinted PATP/AuNPs/GCE上膜的孔穴,使铁氰化钾的传质速率降低.图3插图所示为不同修饰电极的相应的循环伏安行为,其变化趋势与交流阻抗图是一致的.

2.2培养时间对imprintedPATP/AuNPs/GCE的影响培养过程是一个能有效地提高印迹电极灵敏度的步骤.图4为印迹电极培养时间与铁氰化钾峰电流响应关系曲线.实验过程如下:首先将imprinted PATP/AuNPs/GCE浸入到5.0×10-8mol/L SAL标准溶液中培养不同的时间,然后用超纯水清洗电极1 min,再将印迹电极置于5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行循环伏安定量测定电流响应值.由图可知,铁氰化钾的峰电流随培养时间的增长先快速减小,当培养时间达到12 min后,峰电流的值变化缓慢,基本维持稳定,说明达到印迹平衡.因此,选择12 min作为印迹最佳培养时间.

图2 电极(a)GCE、(b)GNPs/GCE、(c)SAL-PATP/GNPs/GCE和(d)non-imprinted PATP/GNPs/GCE在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-探针溶液中的循环伏安曲线.扫速(0.1 V/s)

图3 修饰电极(a)SAL-PATP/GNPs/GCE、(b)imprinted PATP/GNPs/GCE和(c)imprinted PATP/GNPs/GCE after incubation in 5.0×10-8 mol/L SAL在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-探针溶液中的交流阻抗谱图(插图为各修饰电极相对应的循环伏安曲线)

2.3阻抗测定图5为imprinted PATP/AuNPs/GCE在不同浓度的SAL溶液中培养12 min,超纯水清洗后,在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗叠加图谱.由图可知,培养后印迹电极的Rct值随SAL的浓度的增大而增大.图5插图为印迹膜和非印迹膜的校准曲线.实验表明:培养后印迹电极的Rct值与SAL浓度在6.2×10-9～2.4×10-7mol/L范围内呈良好的线性关系(图5插图线性曲线),线性回归方程为:Z′/ohm=6 058+2.79C,线性相关性系数为0.999,检测限为3.1×10-9mol/L(S/N=3).对non-imprinted PATP/AuNPs/GCE采取同样的测定过程,培养后non-imprinted PATP/AuNPs/GCE的Rct值与浓度不呈线性关系(图5插图散点),且很快呈吸附饱和状态,这与non-imprinted PATP/AuNPs/GCE上聚合膜相对较厚和缺乏与SAL特异性结合位点有关.

2.4传感器选择性、稳定性和重现性对浓度为5.0×10-8mol/L的SAL溶液进行干扰试验,在有干扰物质存在的情况下,SAL的检测电流相对误差超过5%视为存在干扰.实验结果如图6所示,结构与SAL最接近的肾上腺素、特布他林和克伦特罗最高不干扰浓度为其200倍;多巴胺、尿酸和葡萄糖对SAL的最高干扰浓度为500～1 000倍;而抗坏血酸的最高干扰浓度仅为50倍,这可能是由于其分子较小,很容易进入imprinted PATP/AuNPs/GCE的孔穴而阻止电化学探针分子的电子传递.这种良好的选择性取决于印迹膜中存在与SAL分子大小相匹配的孔穴以及印迹膜与SAL间特异性的结合.

图4 峰电流随培养时间的影响

图5 峰电流随沙丁胺醇浓度的影响

图6 干扰物质对沙丁胺醇检测结果的影响

采用交流阻抗法研究了imprinted PATP/AuNPs/GCE重现性和稳定性.用同一支印迹传感器在浓度为5.0×10-8mol/L的SAL溶液中培养12 min,二次水冲洗后进行实验,连续重复5次培养、测定、洗脱过程,其峰电流的相对标准偏差为3.7%,采用5支不同的修饰电极对5.0×10-8mol/L的SAL溶液进行测定,相对标准偏差为4.7%.此外,电极重复50次培养、测定、洗脱过程,对同浓度的SAL溶液的阻抗响应值几乎保持不变.上述实验结果表明,该印迹电极具有良好的重现性和稳定性.

2.5实际样品检测为探究此传感器的实际应用能力,我们将此膜传感器用于猪饲料中SAL含量的测定.猪饲料的处理过程如下:称取1.0 g猪饲料加入到20 mL的离心管中,再加入10 mL新制备的磷酸-甲醇萃取液,超声0.5 h后,离心(10 000 r/min)2 min,取上层清液进行分析.加标回收实验结果如表1所示,回收率为95.1%～103.8%.实验结果表明该方法所测结果准确,可用于SAL实际样品的测定.

表1 猪饲料样品的加标回收率

3 结论

综合利用电聚合方法的优点和PATP与AuNPs之间的相互作用,制备了沙丁胺醇印迹膜传感器.该修饰电极用于猪饲料中沙丁胺醇含量的测定,方法简便、快速、灵敏度高、重现性和稳定性好,具有潜在的应用前景.

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