结核分枝杆菌临床分离株对四种注射用抗结核药物耐药及交叉耐药分析

常珊 付育红 李琦 卜建玲 黄海荣 马玙 陈效友

WHO 2010年报告［1］，我国在耐多药结核病患者数量最多的5个国家中居首位。2008年全国耐药结核病基线调查报告指出［2］，我国结核病总耐药率37．39%，耐多药率8．32%，广泛耐药率0．68%，2010年全国第五次结核病流行病学调查［3］结果报告耐多药率为6．8%，由此可估算我国近5年每年新发耐多药结核病患者约9．8万～12万例，远高出全球平均水平，防控形势十分严峻。链霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）和卷曲霉素（Cm）均属于注射用抗结核药物，是耐药结核病治疗方案中的重要组成部分。由于对这四种药物之间的交叉耐药关系一直存在争议，为了更好地使用这一类药物，组成更合理的耐药结核病的治疗方案，笔者对本院2004—2010年所有的临床分离株的4种注射剂的耐药情况进行分析，并报告如下。

材料和方法

一、菌株来源

4247份结核分枝杆菌临床分离株来自2004年1月至2010年12月北京胸科医院就诊4247例患者的痰液标本，所有阳性菌株经对硝苯甲酸（PNB）及噻吩二羧酸肼（TCH）进行菌种鉴定为结核分枝杆菌。其中：2004年256份，2005年353份，2006年335份，2007年631份，2008年711份，2009年988份，2010年973份。来源患者中男2629例，女1618例；年龄3～92岁，平均年龄（49．32±8．71）岁。

二、培养方法及药物敏感试验

所有菌株采用改良罗氏培养基进行结核分枝杆菌培养，两浓度的绝对浓度法进行药物敏感试验，S、Km、Am和Cm的药物敏感试验方法参照文献［4］，4种药物耐药菌株的入选均以每种药物10μg／ml的含药培养基上生长菌落占据1／4斜面及以上（＋～＋＋＋＋）作为标准。4种药物均购自美国Sigma公司。质控菌株为 H37Rv（ATCC27294）标准株，为本院参比实验室保存。

三、统计学方法

应用SPSS 13．0统计软件进行数据统计处理，4种药物之间总耐药率的差异采用配对χ2检验及χ2分割法，以P＜0．007 14为差异具有统计学意义。4种药物之间交叉耐药率的差异采用两个样本率比较的χ2检验，以P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1．总体耐药情况：总计4247份标本中，S的耐药 率 为 45．11% （1916／4247），Km 的 耐 药 率 为17．93% （718／4005），Am 的 耐 药 率 为 19．02%（792／4164），Cm 的耐药率为 9．44%（401／4247）。经配对χ2检验，Cm与S、Am、Km之间耐药率差异有统 计学意义，χ2值 分 别为 1349．34、281．54、193．16，P值均＜0．007 14。经配对χ2检验，S与Am、Km之间耐药率差异有统计学意义，χ2值分别为821．10、869．28，P 值均＜0．007 14。经配对χ2检验，Am与Km之间耐药率差异有统计学意义，χ2值为13．98，P 值＜0．007 14。因此，4种药物的耐药率以S的耐药率最高，Cm的耐药率最低，Am排在S之后，Km排在Am之后，即S＞Am＞Km＞Cm。4种药物耐药率在不同年份的具体数值及总体耐药率的结果见表1。从近7年的耐药率变化来看，S的耐药率一直高于其他3种药物，且较为稳定，另外3种药物的耐药率在2008年及2009年出现了小幅度的升高，到2010年又有所下降。

表1 4247份标本4种药物的总耐药率

2．交叉耐药情况：（1）S在Km、Am和Cm 3种耐药株中的 耐 药 率 分 别 为 82．59% （593／718）、77．78%（616／792）和76．81%（308／401）。经统计学处理，χ2值分别为502．959、453．911、626．654，P值均＜0．05。（2）Km在S、Am和Cm 3种耐药株中的耐药率分别为33．13%（593／1790）、83．31%（634／761）和67．89%（260／383）。经统计学处理，χ2值 分 别 为 502．959、12．079、100．536，P 值 均＜0．05。（3）Am 在S、Km 和Cm 3种耐药株的耐药率分别为32．78%（616／1879）、89．55%（634／708）和77．95%（304／390）。经统计学处理，χ2值分别为453．911、12．079、163．761，P 值均＜0．05。（4）Cm在S、Km和Am 3种耐药株中的耐药率分别为16．08%（308／1916）、36．21%（260／718）和38．38%（304／792）。经统计学处理，χ2值分别为626．654、100．536、163．761，P 值均＜0．05。

讨 论

本资料分析结果显示，4种药物总的耐药率由高到 低 依 次 为 S （45．11%）、Am（19．02%）、Km（17．93%）、Cm （9．44%）。4种药物耐药率高低顺序结果与2008年王生伟等［5］报道一致。施旭东等［6］2004年报道1046份改良罗氏培养药物敏感性试验结果显示，S耐药率30．3%，Km 耐药率10．5%，Am耐药率8．2%，Cm 耐药率3．3%，本研究中4种药物的耐药率与之比较都偏高，可能与样本量的大小、标本来源于不同地区及4种药物的近6年来使用频率不同有关。本研究结果提示Am的耐药率略高于Km耐药率，与施旭东等［6］研究结果不同，可能与近几年来Am的使用率高于Km有关。另从近7年耐药率变化来看，4种药物的耐药率都呈现出逐渐上升的趋势，但2010年的耐药率又有所回落。2010年全国第五次流调结果与2008年耐药结核病基线调查报告的结果相比较，耐多药率是有所下降的，本研究结果与此变化趋势是一致的，2010年4种药物耐药率的下降可能与耐多药结核病比率下降有关。

这4种药物均为注射用抗结核药物。除Cm为环多肽类药物外，其他3种均属于氨基糖甙类药物。两类药物均以抑制细菌蛋白质的合成为主要机制，但作用靶点不完全相同［7］。自氨基糖甙类药物诞生起，即陆续出现对这类药物存在交叉耐药现象的报道。交叉耐药是指细菌对一种抗菌药产生耐药后，对其他作用机制相似的抗菌药也产生耐药性。通常认为S与Km和Am为单向交叉耐药，Km和Am之间为完全交叉耐药，这3种药物与Cm之间为单向交叉耐药［7］。但文献报道结果并非完全一致。1987年，岩井和郎等［8］认为S与Km为单向交叉耐药，但Km和Cm之间为完全交叉耐药。倪正义等［9］报道，对Am低度耐药的患者有92．1%对Km仍然有效，而对Km低度耐药者仅36．4%对Am敏感。上海曹广云等［10］报道448例药敏结果显示，S在Am耐药株和Cm耐药株中的耐药率分别为96．7%和91．2%，而Am在S耐药株中的耐药率为31．2%，Cm在S耐药株中的耐药率为27．5%，因此可以认为S与Am和Cm之间为单向交叉耐药。而Am在Cm耐药株中耐药率为82．5%，Cm在Am耐药株中的耐药率为77%，因此认为两种药物为双向交叉耐药。国外关于4种药物的交叉耐药情况结果也不完全一致，特别是Am和Km之间的交叉耐药情况，差别较大，但通常样本量较小。如Kruuner等［11］和 Maus等［12］的两个研究报道各约80例样本中，耐Km株中仍有50%左右对Am敏感。2009年Jugheli等［13］报道78例Km耐药株中11．5%对Am敏感，20．5%对Cm敏感，而Am耐药株中未见到Km敏感株。本研究结果显示，S在另外3种药物耐药株中的耐药率为76．81%～82．59%，而另外3种药物在S耐药株中的耐药率为16．08%～33．13%，据此认为S与另外3种药物虽然存在交叉耐药，但耐药率差别较大，交叉耐药水平较低，可认为S与其他3种药物之间均为单向交叉耐药，与曹广云等［10］研究结果一致。Cm在另外3种药物耐药株中的耐药率为16．08%～38．38%，另外3种药物在Cm耐药株中的耐药率为67．89%～77．95%，因此Cm与另外3种药物之间也应为单向交叉耐药。2008年，耐药结核病规划管理指南紧急修订版中也认为Cm和其他氨基甙类药物之间有低水平交叉耐药［14］。最后，本研究结果显示，Km耐药株中Am的耐药率为89．55%，Am耐药株中Km的耐药率为83．31%，两者差异虽有统计学意义，但χ2值远远小于其他几组药物，且从临床实际出发，此交叉耐药率的差别过小，应认为两者为完全交叉耐药。提示，在临床用药中，应优先推荐遵从S到Am到Cm的单向用药顺序，另当S耐药时可选择使用Am或者是Km，当Am和Km耐药时可以选择使用Cm。

目前研究认为，4种药物交叉耐药产生的原因是由于存在共同的基因突变位置。如S的耐药主要由于rspl和（或）rrs基因突变所致［15］。其他3种药物耐药均有rrs基因突变参与［13］。而Cm的耐药产生与rrs、thyA及gidB3个基因突变均有关联［16］。其中Km和Am的耐药产生均与rrs1401位点的突变密切相关，特别是高浓度耐药时，其基因型和表型的关联更为密切［17，18］。多个文献报道均发现不同形式、不同程度的交叉耐药经常表现为不同形式的基因突变［12，16，18］。但本研究并未对4种药物耐药株的相关耐药基因突变情况进行检测和分析，因此尚不能从基因水平说明4种药物交叉耐药的分子机制。

从本研究所总结的7年的临床资料来看，4种药物的耐药率从高到低依次为S、Am、Km、Cm，4种药物之间均表现出交叉耐药，但程度不同。S与其他3种药物之间为单向耐药，Km和Am两个药物之间近似完全交叉耐药，Cm与其他3种药物之间为单向耐药。

［1］WHO．耐药结核病临床医生使用指南．2版．北京：中国疾病预防控制中心结核病防治中心，2010．

［2］中华人民共和国卫生部．全国结核病耐药性基线调查报告（2007—2008年）．北京：人民卫生出版社，2010．

［3］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室．2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告．中国防痨杂志，2012，34（8）：485-508．

［4］中国防痨协会．结核病诊断细菌学检验规程．中国防痨杂志，1996，18（1）：28-33．

［5］王生伟，张侠．1996—2006年南京地区结核病耐药状况分析．中国防痨杂志，2008，30（5）：408-410．

［6］施旭东，王雷．卷曲霉素对结核分枝杆菌体外抑菌作用的研究．江苏大学学报医学版，2004，14（2）：100-102．

［7］肖和平．唐神结．耐药结核病防治手册．北京：人民卫生出版社，2009．

［8］岛尾忠难．结核病学．北京：人民卫生出版社，1987．

［9］倪正义，熊建刚，凡毅．丁胺卡那与卡那霉素对结核杆菌的交叉耐药情况分析．医师进修杂志，2000，23（7）：10．

［10］曹广云，肖和平，闫丽萍，等．三种注射用抗结核药物对结核分枝杆菌的耐药情况分析．中国防痨杂志，2010，32（4）：227-230．

［11］Krüüner A，Jureen P，Levina K，et al．Discordant resistance to kanamycin and amikacin in drug-resistant Mycobacterium tuberculosis． Antimicrob Agents Chemother，2003，47 （9）：2971-2973．

［12］ Maus CE，Plikaytis BB，Shinnick TM．Molecular analysis of cross-resistance to capreomycin，kanamycin，amikacin，and viomycin in Mycobacterium tuberculosis．Antimicrob Agents Chemother，2005，49（8）：3192-3197．

［13］Jugheli L，Bzekalava N，de Rijk P，et al．High level of cross-resistance between kanamycin，amikacin，and capreomycin among Mycobacterium tuberculosis isolates from Georgia and a close relation with mutations in the rrs gene．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5064-5068．

［14］WHO．耐药结核病规划管理指南．2008年紧急修订版．北京：中国疾病预防控制中心结核病防治中心，2008．

［15］吴雪琼．结核分支杆菌耐链霉素分子机制的研究进展．微生物学免疫学进展，1998，26（3）：83-85．

［16］Via LE，Cho SN，Hwang S，et al．Polymorphisms associated with resistance and cross-resistance to aminoglycosides and capreomycin in Mycobacterium tuberculosis isolates from South Korean patients with drug-resistant tuberculosis．J Clin Microbiol，2010，48（2）：402-411．

［17］Sirgel FA，Tait M，Warren RM，et al．Mutations in the rrs A1401Ggene and phenotypic resistance to amikacin and capreomycin in Mycobacterium tuberculosis．Microb Drug Resist，2012，18（2）：193-197．

［18］Georghiou SB，Magana M，Garfein RS，et al．Evaluation of genetic gutations associated with Mycobacterium tuberculosis resistance to amikacin，kanamycin and capreomycin：a systematic review．PLoS One，2012，7（3）：e33275．