分子印迹技术在食品安全检测领域中的研究进展

高杨菲，化占勇，沈利明

（江苏省吴江市农业委员会，江苏 吴江 215200）

随着全球经济一体化和食品贸易国际化发展，食品安全问题已成为全世界关注的热点。近年来，我国的食品安全问题频发，对 环境和人类造成危害，这对食品安全检测水平和技术提出了挑战。目前应 用于食品安全检测的技术手段或方法主要有：色谱 法、酶法、免疫法、传感器法和生物检测方法等，这些方法都需要对样品进行前处理，去 除干扰杂质； 但在样品量大，成分复杂的情况下上述方法不适宜 现场快速检测，而且存在检测成本高，检测重现性 不好等问题。研发更为快速、准确、灵敏的检测方法已经变得迫切需要。在此背景下，许多学者积极 开发新的检测技术或待检样品分离技术，分子印迹 技术(molecularly imprinting technology,MIT)应运而 生。该技术是一种新型高效分离及分子识别技术，由于其具有优越的识别性和选择性，在食品安全检 测中发挥着重要的作用。

1 分子印迹技术

分子印记技术源于1940年Pauling[1]在免疫学研 究中提出的抗体形成学说，即用抗原作为模板来铸 造对应抗体空间结合位点的结合理论。到1973年，Wulf等[2]成功发展了用于色谱手性拆分印记聚合 物。分子印迹的基本原理是[3]：在目标底物的存在下，充当分子模板的印记分子与功能性单体混合，在一定的溶液中利用交联剂与功能性单体聚合，从 而在模板分子周围占据着高度交联的聚合结构；随 后印记分子移去，暴露出一个相对于模板分子空间 构型相互匹配的具有多重作用点的空穴，此空穴与 印记分子在形状、大小等方面具有良好的互补性，因而这种聚合物具有特异性识别印记分子的功能。

近几年发展起来的分子印记技术[4]所得到的模 拟生物聚合物(MIPs)与生物识别元件(如酶、抗体、核酸等)相比具有很多优点：(1)MIPs的稳定性好，能反复使用50次以上；在室温干燥环境中可保存数年，水中保存4周以上不会影响其性质；用酸性、碱 性、金属离子和其它多种溶液处理时不会降低其识 别特性；能耐受一定的机械强度、高温及高压。(2)MIPs具有很高的选择性，它对印记分子而言是“量身定做”的，而且理论上任何一个分子均可制 备相应的MIPs[5]。(3)生物识别元件来自于生物源，在生产过程中往往要使用动物，而分子印记技术完 全是化学合成过程。(4)生物分子识别系统不易建立 批量生产工艺，所以价格昂贵，而MIPs则费用低，对于某些小分子化合物如药物来说，制备其MIPs相 当简单省时，容易建立大规模生产[6]。

1.1 分子印迹技术的原理和方法

分子印记技术的原理：(1)功能单体与目标分子的功能基团在适当的条件下可逆结合，形 成复合物；(2)加入交联剂，使其与功能单体聚合，形成的聚合 物将目标分子包埋在内；(3)用一定的物理和化学方法，将模板分子(即目标分子)从聚合物中洗脱，以获得具有识别功能并与之相匹配的三维空穴。这样，可以再次选择性地与模板分子结合，从而具有专一识别模板分子的功能[7]。过程如图1所示[8]。

图1 分子印迹聚合物的制备流程

迄今为止，分子印记技术主要有两种：（1）共价键法（预组装）共价键法是由Wulff等人创立 发展起来的。该方法中印记分子(目标分子)和功能 单体以共价键的形式结合生成印记分子的衍生物，该聚合物进一步在化学条件下打开共价键使印记分子脱离。功能单体一般采用小分子化合物。共价键 结合作用包括硼酸酯、西佛碱、缩醛(酮)、酯、螯 合键作用等。共价键法主要应用于制备各种具有特 异识别功能的聚合物，如糖类及其衍生物、甘油酸 及其衍生物、氨基酸及其衍生物、扁桃酸、芳香酮、二醛、三醛、铁转移蛋白、联辅酶及甾醇类物质[9]。（2）非共价键法（自组织法）非共价键法是由Mosbach等[10]发展起来的。即把适当比例的印记分子与功能单体和交联剂混合，通过非共价键结合在一起生成非共价键印记分子聚合物。这些非共价键 包括氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。此法主要应用于下列物 质的分离中：染料、二胺、维生素、氨基酸衍生物、多肽、肾上腺素功能药物阻抑剂、茶碱、二氮杂苯、核苷酸碱基、非甾醇类抗感染药莱普生和苄胺等。

共价键法和非共价键法的主要区别在于单体与 模板分子的结合机理不同[11](图2)。

1.2 分子模拟在分子印迹技术中的应用

随着计算机技术和量子化学理论的发展，分子 模拟的方法已被用于解释分子印迹聚合物的分子识 别的机理、选择功能单体、确定模板分子与功能单 体的比例和优化分子印迹的体系等。

1.2.1 解释聚合物识别机理 Wulff[12]利用MolCAD 1.0 分别计算以α-D-甘露吡喃糖苯苷为 模板，4-乙烯基苯硼酸为功能单体的共价型分子印 迹聚合物和以L-苯丙氨基酰替苯胺为模板，α-甲基 苯烯酸为功能单体的非共价型分子印迹聚合物的模 板-功能单体复合物的静电势能面，并 且认为静电势 能面可以很好地并且直观地描述分子印迹聚合物中对模板分子具有特异性识别作用的孔穴，且孔穴的大小与模板分子的大小在同一个数量级。

1.2.2 证实和预测功能单体与模板分子之间相互作用力Takeuehi等[13]用Monte Carlo构象搜索的方法，找到了在以生物素甲酯为模板的预组装溶液中 可能存在的模板-功能单体复合物的构象，从 构象图 中可以清楚地看到模板-功能单体之间氢键相互作 用的情况。李 萍[14]等 用Hypeehem软件模拟了以右旋 邻氯扁桃酸为模板，以丙烯酰胺为功能单体的分子 印迹预聚合物。2005年Dumitru等[15]用state-of-the-art工具筛选功能单体制备茶碱及其衍生物的分子 印迹聚合物。后 来，D umitru等[16]用模拟的方法发现 静电力在分子印迹聚合物聚合过程中扮演重要的角 色。

图2 分子印迹聚合物共价结合和非共价结合的两种途径

1.2.3 分子模拟用于功能单体的选择和功能单体与模板分子比例的确定Piletsky等用分子模拟研究 分子印迹的重点就是功能单体的选择和功能单体- 模板比例的确定。其核心思想是功能单体与模板之 间具有较强的相互作用，而且功能单体－模板处于合适的计量比时，合成的MIPs具有最高的识别性 能。模板分子与功能单体的相互作用可用以下公式 计算：△E=E（模板-功能单体复合物）－E（模板）－∑E（功能单体）

在上述指导下，S ergeyeva等[17]先 利用Hypeche于1999年研究了阿特拉津和甲基丙烯酸的复合物，发现模板和功能单体之间可以形成2个离子键、2 至3个氢键，说明模板和功能单体之间具有较强的相互作用，所 以选择 MAA作为功能单体是合适的。随后 Piletsky等[18]使 用SYBYL软件在SGI工作站 上建立了模板（麻黄素）和20个通常使用的功能单 体的构象，这些功能单体就组成了虚拟的功能单体 库，然后通过 MAX1MIN2 关键字利用分子力场的方法优化模板和功能单体的构象，并且用Gasteiger-Huckel 方法计算电荷，再 用Leapfrog算法 依次将功能单体与模板分子在各种可能的部位对 接。

1.2.4 分子模拟的研究对印迹体系的优化武利庆[19]用分子模拟系统全面地研究了几种 MIPs 体系，建 立 MIPs 选择性预测的理论模型。在此基础上，他 将所建立的分子模拟方法应用到功能单体种类的筛 选、功能单体比例的优化以及致孔剂的筛选上。

2 在食品安全检测领域的应用

Chapuis等[20]报 道了以特丁津和莠灭净为模板 分子，采用低温紫外引发制备印迹聚合物，用该聚 合物装填 3mL 固相萃取柱，能从复杂基质葡萄酒 和土壤中选择性萃取加标莠去津及其代谢物，在10-8级检测中，能达到基线平稳、定量准确。分离 效果与免疫亲和层析柱(immunosorbents IS)相当。De Prada等[21]研 究了一种在线 MISPE 过程用来选 择性富集和伏安法测定牛奶中衡量的磺胺甲基嘧 啶，通过实验得到的浓缩因子为45。这种方法的检 测限低于国际食品法典委员会标准规定(牛奶中磺 胺甲基嘧啶的最大残留量 25mg/L)，因此可以定量的检测牛奶中的磺胺甲基嘧啶残留。Puoci等[22]建 立一个简单的MISPE，方法从食品中预富集痕量的苏丹红，结果表明当使用HPLC 不能检测到苏丹 红时，M ISPE是一个有效地检测痕量苏丹红的方法。周文辉等[23]采 用以三聚氰胺为模板分子合成了对三聚氰胺具有较好选择性的分子印迹聚合物。以该分子印迹聚合物为固相萃取材料填充固相萃取小柱，可以从奶粉、纯 牛奶等奶制品中选择性地分离、富集三聚氰胺，并有效地去除奶制品中的复杂基质，取得了良好的效果。对奶粉和液态奶提取液的加标 回收率分别为 91%～103%、93%～98%，相对标准偏 差(n=3)分别为 719%和111%。该 分子印迹聚合物还有望用于其它奶制品的分析。Maier等[24]用MISPE 方法来检测红酒中的致癌物质毒汁菌素赭曲霉素，他们发现非印迹聚合物与 MIPs对模板分子具有相 类似的选择性，并 且将NIPs 代替 MIPs 作为 SPE的吸附剂来避免模板分子的流出。Z hou等[25]发 明了一种在线 MISPE2PE 方法，使用荧光检测器来快速检 测小麦中的赭曲霉素A，每一个分析过程低于5min。而且，M ISPE2PE 与 LC/MS 联用可以对赭曲霉素 A 进行快速的定性和定量分析。

3 展 望

分子印迹技术经过近十多年的发展，其优良的性能 以及对目标物的特异性吸附其在手性物质分离、仿 生传感、固相萃取、抗体模拟和催化等领域被得到 了广泛应用。分子印迹技术凭借其具有的特异结合 性和较强的耐受能力，回收率高等优点，在食品安 全检测领域已经得到广泛的应用。但仍然存在一些问题，如：聚合物的形态和传质机理还不够明晰； 功能单体、交联剂和聚合方法的选择使用都有较大的局限性；吸附动力学过程缓慢；吸附过程机理不 明确、不能广泛应用于水相体系；对大分子物质的印迹仍然是一个难题等在某种程度上阻碍了分子印 迹技术的应用。

随着各种新型材料的不断涌现，结合新型材料的分子印迹技术己成为分子印迹研究的热点。结合 新型材料的特性，发挥不同材料的优点以解决分子 印迹技术存在的问题是今后分子印迹发展的趋势之 一。分子印迹方法的不断改进、新的功能单体不断 出现、各种新型材料不断引入都将不断推动分子印 迹技术在更高层次上继续发展。总之，随着生物技 术、电子技术、合成手段和现代分析检测手段的迅 猛发展，分子印迹技术将日益完善，其必将在食品 安全检测中发挥更大的作用。

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