制备可溶性肿瘤坏死因子受体II－脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较

黄世高，尹玉婷，熊春晖，王彩虹，吕建新，高基民

温州医学院 浙江省模式生物技术与应用重点实验室，浙江 温州 325035

生物反应器已广泛应用于表达大量重组蛋白，用于生产重组蛋白药物的表达系统通常选用哺乳动物中国仓鼠卵巢 (Chinese hamster ovary，CHO)细胞[1-3]。但目前利用动物细胞表达系统获得蛋白比较困难，一方面动物细胞表达蛋白量比较低，另一方面国内大规模培养动物细胞技术及仪器设备尚未十分成熟。类风湿性关节炎已成为危害人类健康最常见、最难治的疾病之一[4-5]，sTNFRII单体是TNFα的天然拮抗剂[6]，sTNFRII-Fc融合蛋白拮抗 TNFa的能力是相应 sTNFRII单体的50～1 000倍[7-8]，sTNFRII-gAD 是借助脂联素[9-11]球部 (Globular domain of adiponectin，gAD)可形成同源三聚体的特性[12]，构建的一种可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部的融合蛋白，用于治疗与肿瘤坏死因子有关的类风湿性关节炎等多种疾病。

本研究主要利用已稳定转染质粒 pAAV2-opti-sTNFRII-gAD并筛选出高表达量的CHO/dhfr−细胞[13]，在生物反应器中经过篮式贴壁培养和全悬浮培养表达融合蛋白，并比较了两种工艺途径生产蛋白的产率，探索细胞在生物反应器中生长的最佳培养方式，进而优化一套高密度、高表达、高效率的融合蛋白中试工艺路径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、试剂及材料

表达重组人sTNFRII-gAD蛋白的CHO工程细胞株D579-dhfr−由本实验室构建。DMEM培养基，胎牛血清购自GIBCO公司；化学成分限定培养基LK021由北京五加和分子医学研究所提供；hTNFR-Fc阳性对照品由复旦张江生物医药公司提供；100 kDa超滤离心管购自Sartorius公司；鼠抗人TNFRII单抗购自Abcam公司；马抗小鼠 IgG/磷酸酶标记抗体购自中杉金桥公司；BCIP/NBT购Calbiochem公司；葡萄糖监测试剂盒购自南京建成生物研究所；搅拌培养瓶购自CHEMICAI GLASS公司。

1.1.2 主要仪器

7.5 L Celligen310生物反应器购自美国 NBS(New Brunswick Scientific)公司；AKTA纯化仪购自GE公司；Pellicon切相流超滤系统 (包括夹具和膜包)购自Millipore公司；平板滤器 (直径90 mm)购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

采用10个T75培养瓶同时培养CHO细胞，待细胞长满时消化细胞，以细胞密度为 3×105～4×105cells/mL接种于搅拌培养瓶，搅拌转速设定为80 r/min，置于37 ℃、5% CO2培养箱搅拌培养。

1.2.2 生物反应器篮式贴壁培养细胞

将细胞密度为 3×105～4×105cells/mL的活种子细胞接种到7.5 L生物反应器，生物反应器圆盘填充床里填充250 g FibraCel载体，用含10%血清培养基培养 3 d后去除培养基，改加不含血清的LK021培养基培养4 d后收获上清，反应器操作条件：篮式培养pH (7.08±0.1)，DO为60%空气饱和度，温度为37 ℃，搅拌转速开始为50 r/min，培养到第2天就换为70 r/min，培养过程中每隔12 h取样，测定葡萄糖和乳酸盐浓度。共收获4 L细胞培养上清，用于蛋白的浓缩纯化。

1.2.3 生物反应器全悬浮批式培养细胞

取细胞密度为3×105～ 4×105cells/mL的活种子细胞接种到7.5 L生物反应器进行全悬浮培养，培养体积为4.0 L。反应器操作条件：pH (7.08±0.1)，DO为60%空气饱和度，温度为37 ℃。培养过程中每隔约24 h取样，测定葡萄糖和乳酸盐浓度。连续培养7 d，期间以RPC软件进行数据采集，实现计算机在线控制，维持细胞培养条件的稳定。

1.2.4 sTNFRII-gAD蛋白的点杂交检测

取全悬浮批式培养的细胞上清，12 000 r/min离心5 min，点杂交检测上清中目的蛋白的浓度。

1.2.5 培养上清的浓缩及纯化

收集细胞培养上清，离心取上清，再经过0.22 μm 滤膜过滤，完成样品的初步纯化。纯化后的样品再经过 Pellicon切向流超滤系统浓缩。两种工艺浓缩后的蛋白经阴离子交换柱纯化，比较产率。

2 结果

2.1 点杂交检测生物反应器中 sTNFRII-gAD融合蛋白的持续表达

从第2天到结束前1天，每天取5 μL细胞上清做点杂交，标准品用 100 mg/mL TNFR-Fc作对照。结果发现颜色逐天加深，表明CHO细胞在反应器内持续表达 (图1)。

2.2 制备融合蛋白sTNFRII-gAD-工艺流程

工艺流程见图2。

2.3 两种工艺流程生产蛋白情况比较

篮式贴壁培养用4 L的LK021培养基生产蛋白32 mg，纯度为95%，而全悬浮批式培养则用同样培养基生产蛋白30 mg，纯度为98%，悬浮批式培养获得的 sTNFRII-gAD蛋白产量和篮式培养相差不多，但蛋白纯度是篮式培养的1.03倍 (表1)。

图1 蛋白点杂交分析验证融合蛋白的持续表达Fig. 1 Continuous expression of sTNFRII-gAD fusion protein analyzed by protein dot blotting with monoclonal antibody against TNFRII. (A)Lanes 1 to 5: positive controls at 5 μL of 100 mg/L TNFR-Fc. (B)Lanes 1 to 5:detection of sTNFRII-gAD fusion protein in the supernatants of CHO cells after the culture of 24 h, 48 h,96 h,144 h and 192 h .

3 讨论

动物细胞培养开始于20世纪初。1962年，其规模开始扩大，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分[14]。

目前利用生物反应器进行大规模细胞培养并表达目的蛋白具有许多优点：无菌操作，维持温度和pH、DO值稳定，监测控制自动化，因此非常适合基因工程细胞的高密度、高表达培养。但不同细胞的培养方式和表达条件不完全相同，需要注意摸索最佳培养条件[15]。我们构建的sTNFR-gAD融合蛋白表达于上清中，因此需要从上清中提取和纯化目的蛋白。为了提高蛋白产量并利于下游纯化的方便，在生物反应器培养条件下比较了两种细胞培养方式生产的蛋白产率 (表1)。悬浮培养工艺由于培养过程中不用含血清的培养基过渡，所以收集上清中血清含量少，纯化时较易纯化，得到的蛋白纯度较高。而且培养过程中不用更换培养基，经济方便。

图2 制备融合蛋白sTNFRII-gAD-工艺流程图Fig. 2 Schematic diagrams of anchorage-dependent basket (A)and full suspension batch (B)cultures for preparation of sTNFRII-gAD fusion protein.

表1 篮式贴壁培养与全悬浮批式培养的比较Table 1 Comparison between anchorage-dependent basket and full suspension batch cultures for preparation of sTNFRII-gAD fusion protein

本研究利用生物反应器培养含sTNFRII-gAD的CHO工程细胞株表达目的蛋白的工艺在国内外未见报道。其原因是因为转染质粒 pAAV2-optisTNFRII-gAD的CHO/dhfr−工程细胞株是本实验室保存，并已申请专利[16]，该专利是利用了脂联素球部自动形成三聚体的特性与sTNFRII融合基因的策略来获得sTNFRII-gAD重组蛋白，此双功能蛋白拮抗 TNFα的活性比二聚体化 sTNFRII-Fc更高，但尚未进入市场。所以此工艺还处于初步探索设计阶段。篮式贴壁培养工艺，开始因接种细胞数量较少，以30 r/min的低速搅拌有利于细胞均匀分布在罐体内并有效地吸附在填充床的FibraCel载体上，4～6 h后细胞完全贴壁，此时提高搅拌速度为 70 r/min，细胞密度增多后换LK021培养基继续培养3 d。全悬浮批式培养则采用逐渐提高搅拌速度，这样循序渐进，可以使细胞周围微环境中代谢物和营养物质在短时间内达到平衡。两种培养工艺下该工程细胞株较理想的培养条件为恒定温度37 ℃、pH 7.08，pH值在线控制靠CO2和碳酸氢钠的浓度比来维持稳定。

任何动物细胞表达的生物制品，都要经历从获得生产用的工程细胞株系到建立和完善生产工艺的过程。本实验的有些部分如细胞在生物反应器中的扩大培养，细胞培养操作模式，如何加强蛋白三聚体的稳定性等，还需要更加细致深入的研究，总之建立一套成熟的 sTNFRII-gAD融合蛋白制备工艺流程尤为重要。

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