雌激素受体与Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中的表达

张跃蓉　庞磊　刘忠林

[摘要] 目的 探讨雌激素受体（ER）和Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨中的表达情况。方法 采用苏木精-伊红（HE）及免疫组织化学染色法检测ERα、ERβ和Ⅱ型胶原在人胚颞下颌关节髁突软骨各层的表达。结果 Ⅱ型胶原主要表达于髁突软骨的过渡层及肥大层。ERα主要表达于髁突软骨的过渡层及肥大层，均匀分布于细胞内；ERβ集中表达于肥大层，且以细胞核内分布为主。纤维层及增殖层未见Ⅱ型胶原和ER表达，钙化软骨层有少量表达。结论 ER与Ⅱ型胶原在髁突软骨中分布一致，雌激素可选择性地结合不同亚型的ER，从而调节髁突软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的能力。

[关键词] 髁突软骨； 雌激素； 雌激素受体； 人胚

[中图分类号] R 322.4+1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.020

大量的临床病例和流行病学调查表明，雌激素水平的变化可能是导致颞下颌关节紊乱病（tempo-romandibular joints disorders，TMD）的重要原因之一。雌激素发挥生理作用需要雌激素受体（estrogen receptor，ER）的介导，既往研究显示，动物和人的关节均有雌激素受体的表达，证明关节是雌激素作用的靶器官。颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）的结构与功能复杂，并且终生进行适应性改形重建，雌激素对TMJ的效应是否与其他关节相同，目前尚不明确。本研究应用苏木精-伊红（hematoxy-lin-eosin，HE）及免疫组织化学染色法观察ER以及间质胶原在人胚髁突软骨中的表达，并分析两者的重叠关系，以期为TMD的发病机制研究以及临床合理应用雌激素治疗TMD提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验标本、试剂及仪器

髁突软骨取自因母体健康原因水囊引产并自愿捐献的4～5月龄胚胎。ERα多克隆抗体、ERβ多克隆抗体、柠檬酸钠抗体修复液（北京博奥森生物技术有限公司），鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体、通用型二步法免疫组织化学检测试剂盒、山羊血清封闭液、胃蛋白酶消化液、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），倒置相差显微镜（Olympus IX71）、Image-Pro Express6.0成像系统（Olympus公司，日本），自动显微照相装置（Qimaging公司，加拿大）。

1.2 髁突软骨ΗΕ染色

软骨切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化组织切片。苏木精染色4 min，流水冲洗多余染液。1%盐酸乙醇分化5 s，流水冲洗，40 ℃温水返蓝10 min。伊红染色30 s，流水冲洗。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，风干，中性树胶封固。

1.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色

髁突软骨切片分成2组，常规脱蜡水化，滴加3%过氧化氢避光孵育15 min，胃蛋白酶消化30 min，山羊血清封闭30 min，滴加鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体（一抗，即用型）及PBS作为阴性对照组，4 ℃孵育过夜，滴加通用型二抗，DAB显色，常规封固拍照。

1.4 ER免疫组织化学染色

髁突软骨切片分成3组，常规脱蜡水化，滴加3%过氧化氢避光孵育15 min，柠檬酸钠抗原热修复两次，山羊血清室温封闭30 min，分别滴加ERα多克隆抗体（一抗10 μg·mL-1）、ERβ多克隆抗体（一抗10 μg·mL-1），滴加PBS作为阴性对照组，4 ℃孵育过夜，滴加通用型二抗，DAB显色，常规封固拍照。

2 结果

2.1 人胚髁突解剖形态观察

4～5月龄胚胎下颌骨呈粉白色，透光可见红色骨髓，骨质较薄韧性尚存，未完全骨化。下颌体与下颌升支相交呈钝角，下颌升支分成喙突与髁突，两突相交呈“U”形，在乙状切迹处汇合。髁突内外径大于前后径，颈部短小，表面覆盖中央凹陷的关节盘，后斜面大于前斜面，位置略高于前斜面（图1）。

图 1 人胚髁突

Fig 1 Mandibular condylar cartilage of human embryo

2.2 人胚髁突软骨HE染色观察

髁突软骨从关节表面至深层可分为5层。纤维层：9～11层细胞，细胞核染成蓝色，呈卵圆形或梭形；增殖层：5～6层小而密集的细胞，细胞形态从细长三角形逐渐演变成扁平三角形；过渡层：5～7层，呈扁平三角形或椭圆形的细胞；肥大层：10～

11层软骨细胞；钙化软骨层：12～13层细胞，接近骨组织处，细胞体积最大，细胞质呈空泡状，细胞核染成蓝色位于中央，不规则地皱缩呈椭圆形或三角形（图2）。

F：纤维层；P：增殖层；T：过渡层；C：肥大层；K：钙化软骨层。

图 2 人胚髁突软骨 HE × 100

Fig 2 Mandibular condylar cartilage of human embryo HE × 100

2.3 人胚髁突软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察

Ⅱ型胶原在人胚髁突软骨呈不均质性表达：髁突软骨纤维层、增殖层可见小而密集的细胞，细胞核染成深蓝色，细胞质及细胞外基质染成极浅的蓝色，不易分辨；过渡层的细胞外基质染成较浅的棕黄色，细胞核染成深蓝色，细胞质染成浅蓝色，细胞与细胞外基质界限清晰；肥大层细胞外基质染成大片棕黄色，与细胞界限清晰，细胞质与细胞核均染成蓝色；钙化软骨层胞外基质较少，可见少量条状异染棕黄色基质，细胞质与细胞核呈空泡状，染成蓝色，细胞质与细胞核界限不清（图3左）。阴性对照组全部染成蓝色（图3右）。

左：Ⅱ型胶原；右：阴性对照。

图 3 人胚髁突软骨 免疫组织化学 × 100

Fig 3 Mandibular condylar cartilage of human embryo immuno-

histochemistry × 100

2.4 人胚髁突软骨ERα、ERβ免疫组织化学染色观察

髁突软骨的纤维层、增殖层未见ER表达；过渡层可见大量ERα表达，ERα在细胞内分布均匀，细胞质可见棕黄色的异染基质，部分细胞核也被异染成棕黄色，未见ERβ表达；肥大层ERα、ERβ均有大量表达，细胞质与细胞核均被异染成棕黄色，而ERβ集中表达在细胞核；钙化软骨层ERα、ERβ也有少量表达，皱缩的细胞质、细胞核内均可见棕黄色异染基质，此层两种受体表达未见明显差异，细胞外基质染成蓝色，颜色较前几层深（图4、5），阴性对照组全部染成蓝色。

左：ERα；右：ERβ。F：纤维层；P：增殖层；T：过渡层；C：肥大层；K：钙化软骨层。

图 4 人胚髁突软骨 免疫组织化学 × 200

Fig 4 Mandibular condylar cartilage of human embryo immuno-

histochemistry × 200

左：ERα；右：ERβ。箭头所示为染色阳性细胞。

图 5 人胚髁突软骨肥大层 免疫组织化学 × 400

Fig 5 Hypertrophic layers of mandibular condylar cartilage of hu-

man embryo immunohistochemistry × 400

3 讨论

髁突是颞下颌关节的重要组成部分，TMJ行使正常的生理功能与髁突软骨密切相关[1]。作为继发型纤维软骨，髁突软骨组织学特征与始基软骨极为相似[2]，以往学者[3-5]对髁突软骨的组织分层尚未形成一致，多认为髁突软骨由浅入深分为四个带，而谷志远等[6]通过免疫组织化学、原位杂交以及透射电镜方法发现，增殖层浅层和深层在功能和形态上均有不同，增殖深层已向软骨细胞过渡，故认为将其分为2层更合理，藉此将髁突软骨分为5层。本实验结果显示：髁突软骨由浅及深，其细胞形态从细长三角形向扁平三角形变化，最终演变为椭圆形的肥大细胞，细胞体积明显增大，胞浆丰富；功能上分泌细胞外基质Ⅱ型胶原的能力也是从无到有，逐渐增强，Ⅱ型胶原强表达于过渡层和肥大层，这与谷志远等的研究结果一致，由此再次证明髁突软骨主要功能区存在于过渡层及肥大层。

雌激素是机体内非常活跃的一类激素，雌激素的各种作用必须通过细胞内特异的性激素结合球蛋白介导，即雌激素与ER结合后才能发挥其生物学效应。ER是甾体激素受体大家族中的一种，为核受体。目前发现雌激素受体可分为ERα和ERβ两种亚型，这两种受体的天然配体都是雌激素，两者能以相似但不同的亲和力与雌激素结合，且ERα和ERβ在分布上也存在明显的差异。1985年Sheridan等[7]首先用放射性自显影方法证实了成年雌性狒狒髁突软骨中存在雌激素受体，之后国内外学者就ER不同亚型在动物模型上的表达展开了研究，Wang等[8]提取了体外培养的大鼠TMJ纤维软骨细胞ER总蛋白，发现ERα表达高于ERβ；于世宾等[9]发现ERα分布较广，在细胞核及细胞质中分布均匀，而ERβ仅侧重于细胞核的表达。国内研究也得出相似的结论。免疫细胞化学和原位杂交的方法发现：在TMJ的滑膜衬里细胞、关节盘基质细胞和软骨细胞中，ERα有强免疫反应，且主要表达于细胞核，胞浆仅弱表达。本实验应用免疫组织化学方法观察人胚颞下颌关节髁突软骨ER受体的分布，发现ER主要表达在髁突软骨的过渡层和肥大层，其中，ERα分布范围广，过渡层、肥大层、钙化软骨层均有表达，ERβ仅在肥大层和钙化软骨层表达，增殖层及纤维层尚未发现ERα、ERβ表达；ERα在细胞内均匀分布，而ERβ集中表达在细胞核内，表明ERα比ERβ分布更广泛。这提示TMJ是作为雌激素作用的靶器官，其ER介导的作用机制可能不尽相同[10]。

Ⅱ型胶原是髁突软骨细胞外基质的重要组成成分，构成髁突软骨的基本骨架结构，其主要功能是维持软骨的强度和结构的完整性，进而保证髁突软骨正常生理功能的发挥。研究表明雌激素水平与软骨基质的合成及降解有关，雌激素可以抑制软骨细胞分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），并可改善 MMP与金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）之间的平衡协调。另有研究表明，随去势后关节软骨的ER表达水平降低，软骨组织中的MMP表达逐渐增高，使MMP与TIMP的平衡被打破，从而导致Ⅱ型胶原代谢增加，软骨基质破坏。本实验结果证明：雌激素受体与Ⅱ型胶原均主要表达在髁突的过渡层和肥大层，且这些位点正是髁突软骨代谢最活跃的中心，推测雌激素可选择性地与不同亚型ER结合，发挥调节髁突软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的能力，从而影响颞下颌关节的软骨代谢功能，对颞下颌关节行使功能产生影响。

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（本文编辑 李彩）