松节油基萜类化合物对德国小蠊驱避活性及定量构效关系研究*

韩招久 李丙军** 姜志宽 廖圣良 王宗德谭伟龙 陆年宏 郑卫青 郑 剑 贾德胜

(1. 南京军区军事医学研究所，南京 210002；2.江西农业大学，南昌 330045； 3.南昌市疾病预防控制中心，南昌 330045)

蟑螂是最为常见的室内卫生害虫，在世界范围广泛分布，是传播肠道疾病的重要媒介。使用化学杀虫剂是防治蟑螂的常用手段。长期使用化学杀虫剂会导致害虫抗药性的发生，并引起严重的环境污染与健康风险。

传统的杀虫剂大多是作用于中枢神经系统的神经毒剂，使用过程中可能对非靶生物造成伤害。随着时代的发展，人们防治害虫的理念与时俱进。防治害虫的目的是有效地控制危害，杀死并非实现这一目的唯一手段。昆虫驱避剂是杀虫剂的重要替代药剂，一般认为昆虫驱避剂通过作用于昆虫的外周神经系统而干扰或抑制昆虫的行为。昆虫驱避剂不仅可以用于涂抹皮肤保护人畜免遭害虫侵扰，还可用于物品包装和特殊环境阻止害虫侵扰(Petersonetal., 2001)。

萜类化合物在植物精油中广泛存在，有的对昆虫表现出良好的驱避活性。松节油是世界上产量最大的植物精油。利用其主要成分为α-蒎烯和β-蒎烯合成多个系列的萜类化合物，并从中筛选驱避剂是一个重要的研究思路。本课题组现已从松节油基萜类化合物中成功筛选出了对蚊虫驱避活性较好的驱避剂(王宗德等，2005；韩招久等，2005)。本文报道了26个萜类化合物对德国小蠊Blattellagermanica的驱避活性，并计算定量构效关系，从而为萜类蟑螂驱避剂的分子设计、驱避机理探讨，以及松节油开发利用新途径的开辟提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试虫：德国小蠊，南京军区军事医学研究所室内饲养。昆虫饲养室条件：光照时间10 h/d：相对湿度60%～75%；饲养温度25～28℃。试验用虫为羽化10～15 d健康活跃的雄性成虫。

1.1.2药剂：26个萜类化合物为江西农业大学植物天然产物与林产化工研究所提供。

1.2 驱避活性测试方法

参照Peterson等(2002)的方法，并进行相应的改进。把直径为15 cm滤纸对半切成2块，分别标记为处理与对照。将标记为处理的半张滤纸用 1.5 mL 浓度为 20 mg/mL 无水乙醇配制萜类化合物溶液均匀浸透2 min，另半张滤纸用不含样品的溶剂(无水乙醇)浸透(同上)作为对照。滤纸自然晾干 5 min后，把两个半张滤纸切边相对，半圆边靠皿壁放置于直径为 18 cm培养皿中。皿盖中央切1个2 cm×2 cm方孔。用直径1.8 cm、长10 cm的试管通过方孔把1只德国小蠊引入到培养皿中，并用透明塑料片将小孔覆盖，等待 5 min (刚开始投入到培养皿的德国小蠊常惊慌，故需等待一段时间，当其平息下来，再进行试验)，开始用2只秒表分别记录德国小蠊在处理与对照滤纸上停留的时间，观察时间5 min(300 s)。德国小蠊停留在滤纸空白处(滤纸间的区域)的时间，不计入处理和对照滤纸上德国小蠊的停留时间内，但计入总时间(300 s)内。试验重复3次。

1.3 驱避活性计算

驱避率RR(%)=[(对照滤纸上停留的时间-处理滤纸上停留的时间)/300]×100%。

1.4 定量构效关系的计算

1.4.1结构构建与几何优化：应用Gaussian View 4.1构建26个萜类德国小蠊驱避化合物，采用Gaussian 03W进行结构优化，计算水平为HF/6-31G(d)，在结构优化的过程中，由于键长、键角的调整，会存在许多不同能量值的构象，其中最优构象的能量最低，在结构优化完成后即可获得最优构象。

1.4.2结构描述符的计算：利用Ampac 8.16软件对以上计算结果进行格式的转换，并计算部分量子化学描述符，再将转换格式后的所有缔合体结构导入到Codessa 2.7.10软件，计算它们的结构描述符及特定部位描述符(六元环)。描述符包括6种类型：结构组成描述符、拓扑描述符、几何描述符、静电描述符、量子化学描述符和热力学描述符。

1.4.3定量构效关系模型的建立：应用Codessa 2.7.10软件通过启发式方法(Heuristic method，HM)筛选出显著性结构参数，该方法首先对分子参数进行共线性控制，采用预处理的方式进行快速筛选排除掉一些参数，将结构描述符按参数模型的相关系数降序排列， 依次引入剩余结构描述符中与活性或其他性质相关系数最大的结构描述符。因此可以对结构描述符快速筛选，并建立构效关系计算模型。

2 结果

2.1 驱避活性

测试的26个萜类化合物表现出了不同水平的驱避活性(表1)，其中20个化合物为正向驱避活性。薄荷醇的活性最高，驱避率为69.8%。由于α-蒎烯和β-蒎烯具有良好的化学反应性能，能够合成不同系列的萜类化合物。根据碳链骨架结构不同，可分为四元环、六元环、桥环和开链类。根据官能团不同，则可分为醇类、醚类、酯类、酮类等。萜类化合物结构的丰富多样性，以及驱避活性的复杂性，既为合成筛选蟑螂驱避剂提供了潜能，也增加了工作的难度与不确定性。对结构与活性进行定量分析，能够为萜类蟑螂驱避剂的分子设计提供参考，提升针对性。

表1 26个化合物及其对德国小蠊驱避活性Tab.1 26 compounds and their repellency

续表1

Tab.1continued

编号No.化学式Chemical formulation名称Name结构式Structure驱避率Repellency M±SE(%)14C17H30O2内型1-异莰烷基-3-戊醇乙酸酯Endo-1-isocamphanyl-3-pentanol acetate27.6±26.015C18H32O2内型1-异莰烷基-3-己醇乙酸酯Endo-1-isocamphanyl-3-hexanol acetate-25.3±33.616C18H32O2内型4-异莰烷基-3-乙基-2-丁醇乙酸酯Endo-1-isocamphanyl-3-ethyl-2-butanol acetate0.2±7.517C10H14O葛缕酮(又名:香芹酮)Carvone34.6±12.618C13H20O24-(1-甲基乙烯基)-1-环己烯-1-乙醇乙酸酯4-(1-Methylethylene)-1-cyclohexe nyl-1-ethyl acetate45.9±44.019C14H22O24-(1-甲基乙烯基)-1-环己烯-1-乙醇丙酸酯4-(1-Methylethylene)-1-cyclohexenyl-1-ethyl propionate58.4±19.520C10H20O薄荷醇Menthol69.8±14.621C12H22O2乙酸薄荷酯Menthyl acetate33.3±16.822C13H24O2丙酸薄荷酯Menthyl propionate51.2±24.923C10H18O28-羟基别二氢葛缕醇8-Hydroxylcarveol5.2±9.124C11H18O38-羟基别二氢葛缕醇甲酸酯8-Hydroxylcarveol formate54.8±46.125C12H20O38-羟基别二氢葛缕醇乙酸酯8-Hydroxylcarveol acetate13.2±10.326C13H22O38-羟基别二氢葛缕醇丙酸酯8-Hydroxylcarveol propionate51.9±47.0

注：驱避率为3次重复的平均值±标准差

Note: Repllency is Mean±Standard error value of 3 trails

2.2 模型描述符个数的确定

表2 不同描述符个数的模型对应的R2及Tab.2 R2 and of models with different number of descriptors

表3 最优6参数模型Tab.3 Best six-parameter model

表4 模型候选参数的相关矩阵Tab.4 Correlation matrix of the candidate decriptors for model

注：X1：氢原子的最大原子态能量；X2：原子表面带正电部分区域相对于总带电区域的比例分数；X3：分子总偶极的杂化成分；X4：碳原子最大原子态能；X5：原子表面带负电部分区域相对于总带电区域的比例分数；X6：Onsager-Kirkwood溶解能的图像。

Note:X1: Max atomic state energy for a H atom;X2: FPSA-3 Fractional PPSA (PPSA-3/TMSA)；X3: Tot hybridization comp. of the molecular dipole;X4: Max atomic state energy for a C atom;X5: ESP-FNSA-2 Fractional PNSA (PNSA-2/TMSA);X6: Image of the Onsager-Kirkwood solvation energy.

图1 不同参数个数的模型对应R2及Fig.1 R2 and of models with different number of parameters

2.3 最佳定量构效关系模型

利用上面获得6个描述符构建最优定量构效关系模型：驱避率%Y=269.13+15.36X1-77.16X2+0.83X3+1.38X4+0.83X5+2.58X6

获得的最佳QSAR模型，其R2为0.7923，F为23.08，s2为0.028。模型的t检验值、截距及6个结构描述符的具体情况见表2。根据显著性检验，26个样本，显著性水平α=0.01时，6个因素的F值为3.59(李云雁和胡传荣，2005)，表2中模型的F值远远大于这个检验值。X和ΔX分别表示回归相关系数和标准差，该模型根据6个描述符的显著水平按照降序排列。

在表5中列出了驱避剂活性实验值、利用最优计算模型计算出来的驱避活性值，以及二者的差值。计算值和实验值的关系见图2。由表可知，一些结构的活性实验值和计算值之间有较大的差值，反映出在生物活性测试时，不可避免的存在较大的误差，要避免这种误差，解决办法可以是增加的测试次数和改进实验方法等。

表5 模型计算的驱避率与实验值的比较Tab.5 Calculated Repellent Ratio vs experimental RR

图2 模型计算的驱避率与实验值的线性关系Fig.2 Linear relationship between calculated RR and experimental RR

2.4 模型的检验

表6 6参数模型检验Tab.6 Validation of six-parameter model

3 讨论

植物在与昆虫长期协同演化过程中，产生一些抵抗昆虫侵害的物质。驱避是这些物质的一个重要机理。天然的驱避剂主要是植物挥发物。很多植物能够分泌具有昆虫驱避活性的萜类物质(Moraesetal.，2001)。从植物精油中筛选蟑螂驱避剂是一个重要的研究思路，并发现了一些具有良好驱避活性的物(Inazuka，1982; Thavaraetal.，2007)。松节油是世界上产量最大的植物精油，其主要成分α-蒎烯和β-蒎烯具有良好的化学反应性能，可以通过基团引入等方式合成多个系列的萜类化合物。从这些化合物中筛选昆虫驱避剂具有很大的潜力(宋湛谦等，2006)。本项研究测试的26个萜类化合物中有20个表现出了对德国小蠊的正向驱避活性。由于这些萜类化合物存在结构的丰富性，从碳链骨架上包含了六元环和桥环类，从官能团上则包含了醇类、醚类、酯类、酮类等丰富的结构多样性，为筛选蟑螂驱避剂提供了可能。我国的松节油资源十分丰富，年产能达8万t，为萜类昆虫驱避剂的合成开发利用提供了丰富原料。本项研究发现薄荷醇对德国小蠊有较好的驱避活性，具有作为蟑螂驱避剂加以开发利用的前景。随着研究的深入，有望筛选出安全高效的蟑螂驱避剂，改变当前蟑螂防治过于依赖杀虫剂的局面。

萜类化合物结构的丰富多样性，导致生物活性复杂性。这既为筛选蟑螂驱避剂提供了潜力，也增加了工作的难度与不确定性。对化合物进行定量构效关系的分析，能够为蟑螂驱避剂的分子设计提供参考，提升针对性。通过对26个萜类化合物对德国小蠊驱避活性构效关系的定量分析，我们发现影响萜类德国小蠊驱避活性的最主要的6个描述符为Max atomic state energy for a H atom；FPSA-3 Fractional PPSA (PPSA-3/TMSA)；Tot hybridization comp. of the molecular dipole；Max atomic state energy for a C atom；ESP-FNSA-2 Fractional PNSA (PNSA-2/TMSA)；Image of the Onsager-Kirkwood solvation energy。Max atomic state energy for a H atom、Max atomic state energy for a C atom、Tot hybridization comp. of the molecular dipole和Image of the Onsager-Kirkwood solvation energy都属于量子化学描述符，分别表示氢原子的最大原子态能量、碳原子的最大原子态能量、分子总偶极的杂化成分和Onsager-Kirkwood溶解能的图像。FPSA-3 Fractional PPSA (PPSA-3/TMSA) 和ESP-FNSA-2 Fractional PNSA (PNSA-2/TMSA) 属于静电描述符，分别表示原子表面带正电部分区域相对于总带电区域的比例分数和原子表面带负电部分区域相对于总带电区域的比例分数。从这些描述符的含义可知，分子内部原子间的相互影响、分子极性、溶解性等因素对驱避活性有较大影响。