盈江县耕地土壤高效解磷菌的分离筛选研究

钟小玉 于波 张晨光

（1河源市清洁生产中心 广东河源 517000 2青岛中一监测有限公司 山东青岛 266000 3德宏州环境保护局 云南德宏 678400）

磷是农作物生长所必需的三大元素之一。土壤中全磷的含量是十分丰富的，但是可利用的有效磷含量极低，一般当季作物只能吸收5~10%的磷肥，而其中大部分的磷会固定在土壤中，以无效态磷的形式存在，尤其在暴雨冲刷、下渗、侧渗情况下，磷就会进入湖泊、水库造成水体富营养化。如何利用土壤中无效态的磷成了国内外众多农业和环境领域学者所研究的热点课题。

1 材料与方法

一般来说，采样的最佳时间为晚秋或早春采集土样，根据实验安排采样时间定为2012年10月23日。

1.1 培养基的制备

根据余贤美等[1]的研究结果，以有机磷液体培养基作为生物富集培养基，然后在无机磷固体培养基上进行平板稀释法筛选，可以有效的分离筛选土壤中的解磷细菌。

无机磷细菌固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.5g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)210g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，琼脂粉 18~20g/L，蒸馏水 1L，pH 7.0~7.5。有机磷细菌液体培养基：葡萄糖 10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO3 5.0g，（NH4）3PO40.5g，加蛋黄液10mL(蛋黄液为无菌生理盐水与鸡蛋黄1:1配制)，蒸馏水1L，pH7.0~7.5。（生理盐水：9gNaCl溶于1L水中）。本研究中所用的试剂均为国产分析纯试剂。斜面保存培养基（LB培养基）：胰化蛋白胨10g，酵母膏 5g，NaCl10g，琼脂 20g，H2O1L。

1.2 高效解磷菌的分离与筛选

解磷菌的生物富集：称取处理后的土样1g加入到100mL有机磷液体培养基中，于28℃，200～250r/min条件下振荡培养48h。

平板稀释法分离解磷细菌：按 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的梯度进行稀释，对最后5个稀释梯度各取0.2mL上清液，每个稀释度做3次重复，分别在无机磷或有机磷固体培养基平板上涂布均匀，置于28℃培养箱中培养7d，观察平板中菌落生长情况及溶磷圈的产生。将固体培养基上长出的单菌落分别在无机磷细菌固体培养基平板上进行四分体划线分离及纯化，以获得纯菌株。并根据溶磷圈直径与菌落直径的比值筛选目标菌株，并把比值较大的菌株保存在斜面培养基上，放在4℃冰箱中保存备用。

1.3 水溶性磷测定方法

将纯菌株从斜面接种到无机磷固体培养基上，培养7d，再将菌落刮入无菌水中，制成菌体悬浮液，浓度约为108cuf/mL。向250ml三角瓶中加入100ml无机磷液体培养基，再接入2ml菌液，同时做空白对照。28℃，转速200~250r/min，连续培养14d，每隔24h取菌液，3000r/min离心、0.45μm滤膜过滤后，用磷钼蓝比色法测定滤液中的水溶性磷含量，连续测定14d。

2 结果与分析

2.1 解磷圈的测定结果分析

以有机磷液体培养基作为富集培养基，以无机磷固体培养基作为筛选培养基，置于28℃培养箱中培养7d，得到11株具有较大溶磷圈的细菌。根据溶磷圈直径与菌落直径的比值(HD/CD)大小初步确定11个菌株解磷能力的强弱。其中5株较强的解磷细菌HD/CD值详见表1。

由表1可见，PSB23和PSB45这两株解磷菌的HD/CD值分别为4.31和4.07，是这11株解磷菌中最大的两株。

2.2 菌株的形态学鉴定

根据表2、表3的结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版[2]，并结合形态学观察，PSB23和PSB45菌株初步鉴定为芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

2.3 解磷菌溶解磷酸三钙的结果分析

图1 PSB23和PSB45的解磷曲线

图1 可见，随着时间的推延，两待测菌株上清液扣除空白后的水溶性磷含量逐渐增加，其中PSB23上清液含磷量第9天出现峰值，水溶性磷含量为174.86mg/L；PSB45号第10天出现峰值，可溶性磷含量为156.32mg/L。出现峰值后，两待测菌株上清液中水溶性磷含量小幅下降并趋于平衡。

3 结论

从盈江县耕地玉米根际土壤中分离出的两株具有较强解磷功能的菌株PSB23和PSB45经过形态学鉴定为巨大芽孢杆菌，HD/CD最大值分别为4.31和4.07在以Ca3(PO4)2为唯一磷源的无机磷液体培养基中，连续培养14d，最大溶磷量分别为174.86mg/L和156.32mg/L。

[1]余贤美,沈奇宾,李炳龙,等.土壤解磷细菌分离和筛选方法的建立[J],热带作物学报,2008,29(3):321-325.

[2]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰氏细菌鉴定手册[M].科学出版.