温阳除痹汤对硬皮病模型小鼠C T G F的影响

闫小宁 ，张建荣 ，李文彬 ，田庆 ，陈乐

（1.陕西省中医医院，西安710004；2.陕西省友谊医院，西安710068)

硬皮病是一种病因不明的结缔组织病，表现为不同程度地皮肤硬化和内脏器官纤维化。温阳除痹汤是陕西省中医院多年临床实践总结的治疗硬皮病的经验药方，对“阳虚血瘀证”硬皮病疗效显著。由于中药成分复杂，其具体作用机制不明，本实验采用Yamamoto[1]硬皮病动物模型造模方法，研究中药复方温阳除痹汤对硬皮病小鼠模型皮损处细胞因子结缔组织生长因子（connect tissue growth factor,CTGF）蛋白和基因的影响，对其治疗硬皮病的作用机制进行初步探讨，为中医治疗硬皮病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SPF级BALB/c小鼠40只，6周龄，体质量（20±5）g购自西安交通大学医学院动物试验中心。清洁级动物饲养室室温20～24℃普通饲料和水喂养。

1.2 主要试剂和仪器 多克隆抗体兔抗鼠CTGF抗体（1∶50）为武汉博士德生物工程公司产品；凝胶成像系统（上海四星生物技术有限公司）；逆转录试剂盒、PCR试剂（Promega公司）；羟脯氨酸标准溶液：称取10 mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸馏水定容至100 mL（100 mg/L）。再用蒸馏水稀释成1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 mg/L 的系列溶液。羟脯氨酸含量测定试剂（南京建成生物制剂公司生产）。

1.3 主要药品 博来霉素粉针（Bleomycin，BLM），15 mg/支，日本化药株式会社产品，批号：450260；0.01 mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（phosphate buffer，PBS）西安交通大学医学院中心实验室配置。青霉胺：上海医药有限公司信谊制药总厂（批号051102）用蒸馏水配制成2.273 g/L。温阳除痹汤（丹参、桃仁、红花、黄芪、当归、仙灵脾、赤芍、莪术、穿山甲）组成，该方一剂共含生药187 g，生药购自陕西省中医医院中药房，用蒸馏水1000 mL浸泡30 min后在陶瓷煎锅内以中火煎40 min，倒出药液，再加入500 mL蒸馏水将药渣重煎20 min。合并头煎、二煎药液，以小火浓缩至120 mL，使药液浓度为生药1.5 g/mL，2000 r/min离心取上清液，置-4℃冰箱保存。

1.4 实验方法

1.4.1 造模 将40只BALB/c小鼠适应性喂养3 d后按照数字表法随机分为2组，1组8只为对照组；一组32只为造模组。造模组小鼠均剃除背部中央区被毛，模型组以41/2注射针头，皮下注射200 mg/L BLM溶液（博莱霉素磷酸缓冲液）0.1 mL，1次/d连续3周。动物模型见图1。

图1 硬皮病小鼠模型照片

1.4.2 动物给药 造模3周后将造模组小鼠随机分为4组：模型组、生理盐水组、青霉胺组和中药组，各组分别灌服对应药物，给药剂量根据每千克体质量占体表面积的相对比值与人所需剂量换算得出[2]，成人每天中药所含生药量原为3.1 g/kg体质量，折算至小鼠为每天38.75 g/kg体质量，成人每日青霉胺用量为1 g/kg体质量，折算至小鼠为每日12.5 g/kg，用蒸馏水配制成2.273 g/L。各组根据个体质量分别灌服药物，连续给药1个月。最后1次给药24 h后处死全部小鼠，切下注射部位皮肤，一部分10%甲醛固定石蜡包埋，剩余部分置于液氮中储藏备用。

1.4.3 真皮厚度测量 应用医学彩色病理图像分析系统Motic Images Advanced 3.1测量真皮厚度，每张切片测6处，取均值，比较给药后各组真皮厚度的变化。

1.4.4 羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）含量测定称取小块硬皮病小鼠皮肤组织各约30 mg剪碎加水解液水解，然后离心10 min；取上清0.6 mL，依次加入3种试剂后，混匀，60℃水浴15 min，3500 r/min，离心10 min；取上清在550 nm、0.5 cm光径下测定各管的吸光度，之后按照说明书公式计算皮肤组织羟脯氨酸含量。HYP计算公式：羟脯氨酸量=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管浓度（2 mg/L）÷蛋白含量（mg蛋白/mL）

1.4.5 蛋白印迹法检测 提取皮肤组织蛋白匀浆，用紫外分光光度计（650 rim）测定蛋白浓度。组织匀浆、变性处理后经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，4℃将蛋白经2～3 h电转移至硝酸纤维素膜。置膜于含50 g/L脱脂牛奶中(三羟甲基氨基甲烷-吐温20盐酸缓冲液稀释)封闭1 h，分别加入特异性兔抗大鼠CTGF单克隆抗体（1∶1000稀释）及辣根过氧化物酶标记的抗鼠多克隆抗体（1∶5000稀释）进行免疫反应，以增强化学发光显色系统显色，超敏胶片曝光，以GAPDH为内参照。

1.4.6CTGFmRNA表达量检测 采用半定量RT-PCR（reverse transcripition-PCR,RT-PCR）法。PCR引物设计与合成：根据小鼠CTGF（又称fisp-12）mRNA序列（GeneBank accession number:M70642）设计 PCR引物，使用引物设计软件Oligo 5.0版辅助设计。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

上 游 引 物 ：5′-GCCTACCGACTGGAAGACACATTT-3′；下游引物：5′-TTACGCCATGTCTCCGTACATCTT-3′，产物 810 bp。以 β-actin（478 bp）为内对照，引物序列为：

5′-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′；

5′-ACTCATCGTACTCCTGTCTGCTGA-3′。

用Trizol法提取皮肤总RNA，按试剂盒说明书合成cDNA。CTGF PCR反应条件：94℃1 min，45℃40 s，72℃40 s，共30个周期。PCR反应条件：94℃1 min，48℃ 40 s，72℃ 50 s，共 26个周期。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析条带吸光度值，以待测基因/β-actin的比值作为待测基因mRNA的相对表达量。

1.4.7 结果判定标准 western blot及RT-PCR方法半定量检测分析结果判定标准：结果分析阳性（显色）条带的分子质量大小，经Gel Doc1000凝胶成像分析系统进行灰度扫描分析，计算机图像灰度扫描数字转换后，进行统计数字处理。

1.4.8 统计学方法 全部数据用均数±标准差（）表示，用SPSS 17.0软件进行统计学处理，组间差异比较用方差分析。

2 结果

2.1 真皮厚度及皮肤组织HYP含量测定 中药组小鼠真皮厚度及HYP与模型组及生理盐水组相比较降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与正常对照组及青霉胺组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 小鼠皮肤真皮厚度(μm)及HYP含量比较(μg，±s)

表1 小鼠皮肤真皮厚度(μm)及HYP含量比较(μg，±s)

注：与正常对照组、模型组相比较*△P<0.05；*△与青霉胺组相比较P>0.05。

组别 皮肤组织 HYP（μg）对照组 70.12±8.96模型组 112.23±11.62盐水组 108.16±0.17中药组 74.94± 2.81△青霉胺组 75.42± 1.25△△n 真皮厚度（μm）8 112.85±7.228 147.53±6.838 141.83±42.328 114.14±2.81*8 120.24±11.25**

2.2 western blot及RT-PCR结果 通过计算机凝胶成像分析系统进行CTGF蛋白及基因mRNA灰度分析，中药组灰度值与生理盐水组及模型组灰度值相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 2、图 3 和表2。

图2 western blot分析不同刺激条件下CTGF表达

图3 RT-PCR分析CTGFmRNA的表达：810bp；β－actin：478 bp

表2 小鼠皮肤组织CTGF蛋白及CTGF mRNA基因结果分析 (±s)

表2 小鼠皮肤组织CTGF蛋白及CTGF mRNA基因结果分析 (±s)

注：与生理盐水组相比较*，**P<0.05；与青霉胺组相比较△，△△P>0.05。

组别 n CTGF蛋白 CTGF mRNA对照组 8 0.083±0.011 0.058±0.011模型组 8 3.912±0.028* 0.289±0.087盐水组 8 3.417±0.036 0.238±0.082中药组 8 1.061±0.022△ 0.089±0.026*青霉胺组 8 1.061±0.022△△ 0.094±0.013**

3 讨论

硬皮病以局限性或弥漫性皮肤或伴有内脏器官进行性纤维硬化为特征。CTGF是一种与成纤维细胞分裂和胶原沉积密切相关的细胞因子，广泛存在于人类多种组织器官，如肺脏、皮肤等及结缔组织中。病理情况下，CTGF过度表达与硬皮病纤维化的发生密切相关。Igarashi等[3]通过原位杂交检测系统性硬皮病患者病变组织，发现在病变皮损处有强阳性CTGF mRNA的表达，然而同一患者的正常皮肤标本中则无表达。Querfeld等[4]认为CTGF在硬皮病中高表达持续至硬化晚期，且表达程度与硬化程度正相关；国内学者高地等[5]研究发现CTGF可使正常克隆FB I型前胶原mRNA水平上升。因此CTGF被认为是代表硬皮病纤维化程度的标记物，可作为治疗硬皮病的靶分子[6-7]。

祖国医学将硬皮病归属于“皮痹”、“皮痹疽”等范畴。“痹”本意指的是“阻闭不通”的意思，发病病机大都认为与阳气不足、卫外不固、风寒湿邪乘隙侵入，营卫不和、气血凝滞，经络阻隔，痹塞不通所致，所以“阳虚、寒凝、血瘀”是发病的关键[8-9]，温阳散寒活血化瘀是治疗硬皮病的基本治则[10]。温阳除痹汤是陕西省中医院治疗硬皮病的经验方，具有活血化瘀、温阳散寒、温通经络的功效，方中黄芪、仙茅、仙灵脾益气健脾温阳补肾，当归、赤芍、桃仁、红花养血活血疏通经脉，莪术、穿山甲破血化瘀除痹，一味丹参功同四物，全方重在活血化瘀，温阳补肾，经多年的临床实践，疗效较为显著[11]。现代医学研究发现桃仁具有改善血液流变学、抗炎、抗过敏等作用；桃仁、当归、赤芍、丹参等有明显的抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成的作用[12-14]；体外实验观察发现有明显抑制硬皮病皮损成纤维细胞的增殖作用[15]；另据研究，丹参不但抑制硬皮病皮损FB增殖，还降低Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达，促进胶原酶mRNA的表达，诱导正常FB的凋亡[16]。因此中药复方温阳除痹汤从组方特点来看具有扩张血管、抑制成纤维细胞增殖和胶原合成的作用。

本实验研究温阳除痹汤对硬皮病小鼠模型的治疗作用。通过小鼠真皮厚度及羟脯氨酸含量的检测，发现中药组小鼠真皮厚度及羟脯氨酸含量明显改善。western blot及RT-PCR电泳图观测提示CTGF蛋白、基因mRNA在正常小鼠皮肤中几乎不表达，在模型组和生理盐水组有较高表达，在中药组和青霉胺组中有极少表达，说明温阳除痹汤具有改善硬皮病皮肤组织纤维化的作用，温阳除痹汤可以降低CTGF蛋白和CTGF基因mRNA在硬皮病中的表达，即从基因转录及翻译水平抑制CTGF蛋白产生，从而发挥其抗纤维化作用，治疗效果与青霉胺大致相同，这与我们前期的研究结果相符合[17]。温阳除痹汤的抗纤维化作用为寻找有效治疗硬皮病的药物提供了新的启示。但中药复方温阳除痹汤具有的其他可能作用机制如对胶原酶表达的影响等，尚需进一步探讨。

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