2 株乳酸菌对亚硝酸盐的降解作用及其降解机理的初步分析

林浩，林伟锋，陈中

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

亚硝酸盐是公认的一种强致癌物质［1－2］。如何控制并降低泡菜中的亚硝酸盐含量成为食品安全领域研究的热点问题。近年来，国内外对乳酸菌降解亚硝酸盐方面多有研究。张庆芳［3］等人认为，乳酸菌降解亚硝酸盐分为两部分，在pH ＞4.5 的发酵前期主要以酶降解为主;在pH ＜4.0 的发酵后期，主要以酸降解为主。Doods 和Kim［4－6］等人也报道了植物乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、绿色乳杆菌、泡菜乳杆菌等乳酸菌都有降解亚硝酸盐的能力。Yan［7］等人从泡菜中分离到6 株乳酸菌，发现其在MRS 液体培养基中降解亚硝酸盐的能力都较好。

本文选用两种常用的泡菜生产人工接种剂:植物乳杆菌和肠膜明串珠菌，分别接种到液体MRS 培养液中，测定在发酵过程中pH、总酸、活菌数及亚硝酸盐含量变化，并分析各指标间的相关性。试图通过不同指标对亚硝酸盐降解率的影响来确定乳酸菌降解亚硝酸盐的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:植物乳杆菌LP-L134-1-P(简称LP)、肠膜明串珠菌LM-L134-1-P(简称LM)，均来源于华南理工大学轻工与食品学院实验室。

MRS 固体培养基:蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、牛肉膏8 g、酵母膏4 g、吐温－80 1 g、K2HPO42 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、MgSO40.2 g、MnSO40.04 g、琼脂15 g，加去离子水1 000 mL，调节pH6.2 ±0.2

MRS 液体培养基:不加琼脂，其他成分同MRS固体培养基。

1.2 仪器与设备

pHS-25 数显pH 计，上海精密科学仪器有限公司;恒温培养箱;电子秤;手提式高压灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司;紫外可见分光光度计;水浴恒温振荡器，金坛市宏华仪器厂;超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 单菌接种降解亚硝酸盐能力

配制好4 瓶液体MRS 培养液并高温灭菌，静置放凉后加入NaNO2(NaNO2首先在硅胶干燥器中干燥24h，然后紫外灯照射30 min 灭菌)，使其浓度均为150 mg/kg。将两种乳酸菌(LP、LM)菌粉按菌体浓度为106CFU/mL 接种到培养液中，37 ℃下培养72 h。每隔12 h 检测培养液的pH 值、总酸度、活菌数及亚硝酸盐含量。

2 株乳酸菌降解亚硝酸盐能力以亚硝酸盐降解率来表示。

亚硝酸盐降解率/% =( 亚硝酸盐初始含量－降解后的亚硝酸盐含量) /亚硝酸盐初始含量×100

1.3.2 去离子水中直接添加乳酸降解亚硝酸盐

取去离子水添加NaNO2至其浓度为100 mg/L，分别添加乳酸至溶液pH 分别为6、5、4、3，并设置空白对照。所有处理在500 mL 锥形瓶中进行，装液量为250 mL，用透气纱布封口，实验期间将锥形瓶置于37 ℃恒温箱静置，定时检测溶液中亚硝酸盐浓度的变化。

1.4 测定方法

1.4.1 pH 的测定

PHS-25 型酸度计。每个样品重复3 次，取平均值。

1.4.2 总酸度的测定

培养液中的酸性物质主要成分是乳酸等有机酸，用NaOH 标准溶液滴定，以PHS-25 型酸度计测定，终点8.2，结果以乳酸表示。

1.4.3 活菌数的测定

活菌数测定采用平板计数法。

1.4.4 亚硝酸盐测定

采用GB/T5009.33 －2003 方法中盐酸萘乙二胺分光光度计比色法，样品重复测定3 次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 活菌数和亚硝酸盐降解率的变化值及规律

考察了在培养温度37 ℃、接种量106CFU/mL的条件下LP 和LM 在NaNO2浓度为150 mg/kg 的MRS 液体培养液中发酵72 h 内活菌数、亚硝酸盐降解率的变化，结果如图1 所示。

图1 培养液中活菌数与亚硝酸盐降解率变化值Fig 1 Changes of samples in viable cell numbers and nitrite degradation rate during fermentation

从图1 中可以看出，2 株乳酸菌在液体MRS 培养液中均能较好的生长。从进入对数期的时间长短来看，LM 需要的时间更短，增长速率也更快。LM 在培养12 h 后细菌总数可由刚接种时的1.6 × 106CFU/mL 达到菌体最高生长浓度1.49 × 108CFU/mL。从能够得到的最高菌体浓度来看，LP 能达到1.97 ×109CFU/mL，活菌数远高于LM。2 株菌都在培养36 h 后开始进入衰亡期，之后活菌数急剧下降。随着发酵时间的延长，培养液中亚硝酸盐含量都在减少，但LP 在降解速率、能力上明显要优于LM。培养12 h 后，LP 和LM 对亚硝酸盐的降解率分别只有15.36%及18.47%。结合其生长曲线来看，在培养的前12 h 两种乳酸菌正处于迟滞期和对数期前期，细菌生长活动不旺盛，对亚硝酸盐的降解率偏低。而从12 h 开始，LP 对亚硝酸盐的降解率开始快速增长，到36 h 降解率已经达到96.25%，对亚硝酸盐的降解基本已达到顶峰。可能是在这段时间内LP 处于生长的对数期，细菌代谢旺盛，细胞分泌亚硝酸盐还原酶量、产酸量增多，从而达到分解破坏亚硝酸盐的效果。与LP 相比，LM 降解亚硝酸盐能力很弱，在培养的72 h 内对亚硝酸盐的降解率呈缓慢上升趋势，72 h 后降解率才达到最高，仅为38.77%。

2.2 pH 和亚硝酸盐降解率变化值及规律

由图2 可以看出，LP、LM 在发酵过程中pH 变化趋势区别明显。LM 在发酵的72 h 内pH 变化幅度不大，仅由6.2 下降至5.35。结果表明LM 产酸能力很弱，pH 的变化与其所处的生长周期并没有很大的联系。LP 在培养的72 h 内pH 由6.22 降至3.87，下降幅度很大。其中，在培养的前12 h 内pH 变化幅度较小。在12 ～36 h 内LP 的pH 下降速度很快，之后变化幅度渐趋缓和，这与其活菌数变化曲线结果是相一致的。LP 在前12 h 内是处于迟滞期，乳酸菌发酵增长缓慢。在12 ～36 h 内LP 处于对数期，乳酸菌开始快速产酸，故pH 变化很快。之后LP 处于稳定期、衰亡期，随着生长环境中酸度的持续积累，高浓度的酸开始对细菌的生长起抑制作用，活菌数随之下降。综合2 株乳酸菌亚硝酸盐降解率曲线来看，pH 的降低能够有效促进乳酸菌降解亚硝酸盐。从降解效果来看，pH 在大于5.60 时，LM 对亚硝酸盐的降解较少，只有30%左右。而LP 培养液中pH 开始降至4 或以下时，亚硝酸盐含量下降迅速，降解率可达到80%以上，这与张庆芳［3］等人的研究结果一致。

2.3 总酸和亚硝酸盐降解率变化值及规律

从图3 可以看出，2 株菌在培养过程中的总酸与亚硝酸盐降解率变化趋势基本一致。LM 产酸能力很弱，在发酵的72 h 内总酸由0.23%升至0.34%，上升趋势缓慢。与之对应的是其对亚硝酸盐的降解率，发酵72 h 后降解率仅达到38.77%。LP 产酸迅速，在培养的72 h 内总酸由0.20%升至1.80%。在培养的12 ～36 h 内，LP 处于对数期，酸度上升极快，由0.35%上升到1.492%。这段时间内LP 对亚硝酸盐的降解速率也由15.36%上升到96.25%，与总酸的上升趋势极为吻合。

图2 培养液中pH 与亚硝酸盐降解率变化值Fig 2 Changes of samples in pH and nitrite degradation rate during fermentation

图3 培养液中总酸与亚硝酸盐降解率变化值Fig 3 Changes of samples in total acid and nitrite degradation rate during fermentation

2.4 各指标之间相关性分析

用SPSS 软件对培养液中pH、总酸、活菌数和亚硝酸盐降解率简单相关性如表1 所示。由表1 可知，在接入LM、LP 的培养液中，pH 与亚硝酸盐降解率之间的Pearson Correlation 分别为－0.974 和－0.985，|r|均大于0.8，可见培养液中的pH 与亚硝酸盐降解率之间呈高度负相关。同样地，两种培养液中总酸含量与亚硝酸盐降解率之间的Pearson Correlation 分别为0.989、0.998，呈高度的正相关。这表明pH 越小、总酸越高，亚硝酸盐降解率越高。这主要是因为乳酸菌在培养过程中不断产生乳酸，导致发酵液中H+浓度的升高(即pH 的降低和总酸的升高)。较高的酸度可以分解破坏亚硝酸盐，从而使亚硝酸盐降解率升高。而LM、LP 培养液中的活菌数与亚硝酸盐降解率之间的Pearson 相关性仅为－0.067、0.273，|r| ＜0.3，可认为两者之间不相关。活菌数数量的多少反应了乳酸菌所分泌的亚硝酸盐还原酶量的多少，由此说明LM、LP 对亚硝酸盐的酶降解所起作用并不明显，起主要作用的是酸降解。另外，相较于pH 对亚硝酸盐降解率的影响，总酸与亚硝酸盐降解率之间相关性更为显著。说明乳酸菌对亚硝酸盐的酸降解除了游离的H+对亚硝酸盐的分解破坏，乳酸菌在发酵过程中分泌的乳酸等有机酸也有促进作用。乳酸单独对亚硝酸盐的清除作用需要在下一步实验中进行印证。

表1 培养液中pH、总酸、活菌数与亚硝酸盐降解率之间相关性Table 1 Correlation analysis between pH，total acid，viable cell numbers and nitrite degradation rate

2.5 直接添加乳酸对降解亚硝酸盐的影响

从图4 可以看出，往去离子水中添加乳酸后，随着时间的推移亚硝酸盐含量都出现不同程度的下降，而对照组亚硝酸盐含量基本不变。添加的乳酸浓度越多，即溶液初始pH 值越低，亚硝酸盐含量下降的趋势越明显，原因是乳酸可以通过与亚硝酸盐发生歧化反应2H++3NO2－ = NO3+2NO↑+ H2O 去除亚硝酸盐。当添加乳酸调节溶液初始pH 值在5 以上时，亚硝酸盐的降解率在24 h 内不足20%，降解效果不显著。当添加乳酸至溶液初始pH 为4 或以下时，亚硝酸盐含量下降明显，其中初始pH 为3 时，亚硝酸盐含量下降速率很快，在第10 h 的时候降解率即可达到81.98%。这与之前LP 培养液在pH 下降到4 以后对亚硝酸盐的降解率急剧增加的结果是一致的。综合LP、LM 两株菌降解亚硝酸盐的结果，进一步印证了乳酸菌降解亚硝酸盐主要是依靠酸降解。

从图5 可以看出:培养液初始pH 越低，总酸含量也越低，添加乳酸的培养液在24 h 内总酸含量变化并不明显，可能是因为亚硝酸盐含量比较少所以消耗的乳酸量也较少的缘故。初始pH 为3 的培养液中总酸含量在1.06%左右，初始pH 为4、5、6 的去离子水中总酸含量均低于0.2%。结合前面的数据可以推断出:培养液中pH 降至3 以下、总酸升至1.06%以上时对亚硝酸盐的降解效果明显。

图4 添加乳酸后去离子水中亚硝酸盐降解率的变化Fig 4 Variation trend of nitrite degradation rate in deionized water after adding lactic acid

图5 添加乳酸后去离子水中总酸含量的变化Fig 5 Variation trend of total acid in deionized water after adding lactic acid

3 结论

(1)在提供充足营养的情况下，LM、LP 两株乳酸菌都有降解亚硝酸盐的能力，从亚硝酸盐降解速率和降解量来看，LP 对亚硝酸盐的去除效果要好于LM。

(2)在培养的前12 h 内，乳酸菌处于迟滞期，培养液中的pH 偏高、总酸度偏低，乳酸菌对亚硝酸盐的降解可能主要依靠乳酸菌分泌的亚硝酸盐还原酶，但酶降解效果并不十分显著。

(3)2 株乳酸菌培养液中的亚硝酸盐降解率与pH 值呈显著的负相关，与总酸度呈显著的正相关，与活菌数的变化并无明显关系。说明乳酸菌降解亚硝酸盐主要的影响因素是发酵过程中产生的酸，pH 越小、总酸越高，亚硝酸盐降解率越高。

(4)相较于pH 对亚硝酸盐降解率的影响，总酸与亚硝酸盐降解率之间相关性更为显著。说明乳酸菌对亚硝酸盐的降解除了培养液中游离的H+对亚硝酸盐的分解破坏，乳酸菌在发酵过程中分泌的乳酸等有机酸也有促进作用。

(5)往去离子水中添加更高浓度的乳酸，降解亚硝酸盐效果也越显著。当初始溶液pH 值调节至3(总酸为1.04%左右)时，在10 h 后降解率即可达到81.98%，进一步验证了乳酸菌降解亚硝酸盐主要依靠酸降解。

［1］ 秦旭锐，徐斐，黄烨炜，等. 生菜在贮藏过程中亚硝酸盐，硝酸盐含量的变化及其与微生物生长的关系［J］．食品工业科技，2009，30(2):280 － 282.

［2］ 郑桂富，许辉，武杰. 亚硝酸盐在雪里蕻腌制过程中生成规律的研究［J］． 四川大学学报(工程科学版)，2000，32(3):85 －87.

［3］ 张庆芳，迟乃玉，郑燕，等. 乳酸菌降解亚硝酸盐机理的研究［J］． 食品与发酵工业，2002，8(28):27 －31.

［4］ Karen L Dodds，David L Collins-Thomson. Characteristics of nitrite reductase activity inLactobacillus lactisTS4［J］．Canadian Journal of Microbiology，1985，31(6):558 －562.

［5］ J Kim，J Chun，H U Han.Leuconostoc kimchiisp.nov.，a new species from kimchi［J］． International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50(5):1915－1919.

［6］ Cho J，Lee D，Yang C，et al. Microbial population dynamics of kimchi，a fermented cabbage product ［J］．FEMS Microbiology Letters，2006，257(2):262 －267.

［7］ Yan Ping-mei，Xue Wen-tong，Tan Sze-sze，et al. Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai［J］． Food Control，2008，1(19):50 －55.