DEK真核表达载体的构建及其对p53启动子活性的影响

刘婕 ，闫志风 ，张亚楠 ，林娅红 ，丁丽华 ，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放军总医院 妇产科，北京 100853

原癌基因dek最初是从急性髓系白血病患者骨髓细胞中以dek-can融合基因的形式分离而来的[1]。研究表明，DEK与人类多种肿瘤的发生、发展有密切关系。DEK在许多恶性肿瘤如肝细胞癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和宫颈癌中均有过表达[2-4]。DEK可以诱发人类乳头状瘤病毒（HPV）E7靶基因癌变，在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用[5]。同时，在乳腺癌中DEK的表达也明显升高，而且与肿瘤的分级、分型及淋巴结转移相关，在恶性度高和晚期乳腺癌中可以作为一个特异性的靶基因。最近研究发现，DEK与DNA结合影响染色质重构和基因表达，并且可以抑制依赖p53蛋白和不依赖p53蛋白介导的细胞衰老和凋亡[6]。因此，我们从乳腺cDNA文库中获得了DEK全长编码序列,构建了N端带Flag标签的真核表达载体。人胚肾293T细胞转染效率高，常用来检测真核基因的表达，我们将构建的DEK表达载体转染293T细胞，检测其表达。为了检测DEK在乳腺癌中的作用机制，我们利用构建的真核表达载体，在乳腺癌ZR75-1细胞中检测了DEK对p53基因启动子活性的影响，发现在ZR75-1细胞中，DEK降低了p53启动子的活性。我们的研究为进一步检测DEK在乳腺癌发生和发展中的作用奠定了基础，并预示DEK可能成为将来检测和治疗乳腺癌的靶标。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T细胞、乳腺癌ZR75-1细胞、p53全长启动子报告基因质粒均由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自Invitrogen公司；DMEM培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，pfu酶和DNA连接酶购自TaKaRa公司；质粒提取、胶回收和PCR回收试剂盒均为Pro⁃mega公司产品；PCR引物由北京赛百盛生物有限公司合成；转染试剂LipofectAMINE2000购自Invitro⁃gen公司；鼠抗人Flag抗体购自Bethyl Laboratories公司；兔抗人GAPDH和辣根过氧化物酶偶联的IgG抗体购自SantaCruz公司。

1.2 DEK编码序列的PCR扩增

dek基因序列GenBank登录号为NM_003472，根据GenBank中报告的序列设计用于PCR扩增的上游引物（5'-CGGGATCCATGTCCGCCTCGGCCCCTGC-3'）和 下 游 引 物（5'-CGGAATTCTCAAGAAATTAG CTCTTTTACAG-3'），上下游引物5'端分别携带BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点。PCR模板为人乳腺文库。PCR反应条件：95℃变性1 min；95℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸90 s，29个循环；72℃再延伸7 min。PCR扩增所用的酶为pfu酶。

1.3 pcDNA3-Flag载体的构建

以乳腺文库为模板，PCR扩增dek基因序列，切胶回收目的条带，37℃下用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切dek基因片段与pcDNA3-Flag载体，4 h后切胶回收酶切产物，于16℃连接8 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取平板上的克隆至LB培养基中，37℃培养4 h后提取质粒进行PCR鉴定，鉴定为阳性的质粒再经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定。

1.4 Western印迹

转染后收集细胞，加入SDS加样缓冲液，煮沸10 min，离心后取上清液进行SDS-PAGE，转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉于4℃封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉1∶1000稀释的Flag抗体或1∶10 000稀释的GAPDH抗体，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG，室温轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化学发光法显色5 min，压片显影。

1.5 萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定

萤光素酶活性测定按Promega公司试剂说明进行。转染24 h后弃培养基，用PBS洗1次，加入100 μL裂解缓冲液，室温轻摇15 min，将细胞收集到1.5 mL离心管中，振荡5 min，4℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清，取15 μL上清液，用荧光计测定萤光素酶活性。

再取上述上清液10 μL与90 μL含β-巯基乙醇（2.7 ml/L）的Z缓冲液混匀，加入20 μL 4 mg/mL的ONPG溶液，常温放置至出现浅黄色，加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，测定 D420nm值，其中β-半乳糖苷酶活性用于校正细胞转染效率，启动子活性为细胞转染效率校正后的萤光素酶活性。

2 结果

2.1 dek基因的PCR扩增

以乳腺文库为模板，用PCR方法扩增DEK全长编码序列，长度应为1128 bp，DNA凝胶电泳结果与预期大小相符（图1）。

2.2 pcDNA-3-Flag-DEK载体的构建

将PCR扩增的DEK编码序列和pcDNA3-Flag用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切处理，经连接、转化，抗性筛选得到的重组质粒经PCR鉴定为阳性（未显示）。PCR鉴定阳性者再用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定结果进一步表明双酶切后在1128 bp处可见特异片段，而空载体对照无此片段（图2）。DNA序列分析结果证实该插入片段为DEK编码序列（结果未显示）。

2.3 pcDNA3-Flag-DEK载体在293T细胞内的表达

将上述阳性克隆提取质粒后转染293T细胞，对照组转染pcDNA3-Flag空载体，24 h后裂解细胞，Western印迹检测细胞内DEK的表达，以GAPDH为内参。结果见图3，转染pcDNA3-Flag-DEK载体的细胞中表达相对分子质量约43×103的特异性条带，与预期结果相符，表明pcDNA3-Flag-DEK载体携带的DEK编码序列能在293T细胞中表达。

图1 PCR扩增dek基因

图2 pcDNA-3-Flag-DEK的双酶切鉴定

2.4 不同剂量DEK对p53启动子活性的影响

p53全长启动子报告基因质粒与不同剂量DEK表达载体转染ZR75-1乳腺癌细胞后，通过检测萤光素酶活性，测定DEK对p53启动子活性的影响。方法如前所述，启动子活性为细胞转染效率校正后的萤光素酶活性，即为萤光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性。结果见表1，与对照组相比，0.1 μg DEK的表达即可使p53启动子活性降至约1/7；当DEK表达量增加至1 μg时，p53启动子活性降至约1/20。表明DEK明显抑制p53启动子的活性，且对p53启动子活性的调节呈剂量依赖关系（图4，P＜0.05）。因此，DEK可能是调控p53启动子活性的新转录因子。

3 讨论

dek在多种人类侵袭性肿瘤中均表达上调，是很重要的癌基因。也有研究发现，DEK过表达抑制HeLa细胞的衰老，并延长人胶质细胞的寿命；DEK表达缺失可诱导宫颈癌细胞凋亡。因此，DEK可以抑制细胞衰老和细胞凋亡[6]。p53是人类很重要的抑癌基因，当细胞受到内部或外部应激反应（如DNA损伤）时，p53蛋白被活化，并诱导细胞凋亡[7]。某些因素引起p53基因突变或功能丧失，是引发宫颈癌的重要因素，宫颈癌组织中突变型p53蛋白的表达率明显高于慢性宫颈炎。Trisha等发现，DEK通过促进p53的降解而抑制细胞凋亡，且DEK抑制p53下游基因p21和Bax的表达[6]。为了进一步研究DEK在肿瘤中的作用，我们构建了DEK的真核表达载体，发现DEK明显抑制p53启动子的活性。因此，除已报道的DEK在蛋白水平调节p53表达[8]外，我们首次发现DEK在转录水平同样抑制p53启动子活性，可能是调节p53表达的新的转录因子，说明DEK在p53的功能发挥中具有重要的调控作用。后续，我们将进一步研究DEK调节p53启动子的功能及机制。综上，我们成功地得到DEK表达载体，为进一步研究DEK在肿瘤发生、发展中的作用机制，以及临床分子靶向治疗奠定了基础。

图3 Western印迹检测Flag-DEK在293T细胞中的表达

图4 不同剂量DEK对p53启动子活性的影响

表1 不同剂量DEK对p53启动子活性的影响的实验结果（x±s）

[1]von Lindern M,Fornerod M,van Baal S,et al.The transloca⁃tion（6;9）,associated with a specific subtype of acute myeloid leukemia,results in the fusion of two genes,dek and can,and the expression of a chimeric,leukemia-specific dek-can mRNA[J].Mol Cell Biol,1992,12(4):1687-1697.

[2]Wu Q,Li Z,Lin H,et al.DEK overexpression in uterine cer⁃vical cancers[J].Pathol Int,2008,58(6):378-382.

[3]Wise-Draper T M,Mintz-Cole R A,Morris T A,et al.Over⁃expression ofthe cellularDEK protein promotesepithelial transformation in vitro and in vivo[J].Cancer Res,2009,69(5):1792-1799.

[4]Carro M S,Spige F M,Quarto M,et al.DEK expression is controlled by E2F and deregulated in diverse tumor types[J].Cell Cycle,2006,5:1202-1207.

[5]Wise-Draper T M,Allen H V,Thobe M N,et al.The hu⁃man DEK proto-oncogene is a senescence inhibitor and an upregulated target of high-risk human papillomavirus E7[J].J Virol,2005,79:14309-14317.

[6]Wise-Draper T M,Allen H V,Jones E E,et al.Appotosis inhibition by the human DEK oncoprotein involves interfer⁃ence with p53 functions[J].Mol Cell Biol,2006,26:7506-7519.

[7]Vogelstein B,Lane D,Levine A J.Surfing the p53 network[J].Nature,2000,408(6810):307-310.

[8]Kim D W,Chae J I,Kim J Y,et al.Proteomic analysis of apoptosis related proteins regulated by proto-oncogene protein DEK[J].J Cell Biochem,2009,106(6):1048-1059.