LC-MS/MS法检测圆珠笔墨迹中碱性蓝7及其去乙基产物的降解变化

孙其然，罗仪文，向 平，奚建华，杨 旭，徐 彻

（司法部司法鉴定科学技术研究所，上海200063）

碱性蓝7（basic blue 7，又名维多利亚蓝 BO）是芳基乙烷类碱性染料。碱性蓝7的三苯基乙烷结构（见图1）不稳定，特别在光照条件下，会逐级降解，形成去乙基的降解产物（见图1）[1]。利用这一特性，可以在一定条件下判断含碱性蓝7的墨迹（由同种墨水书写在同一纸张上）的相对形成时间[2]。

图1 碱性蓝7（分子式C33H40ClN3，分子量514.1438）

相较结晶紫、甲基紫而言[3-5]，有关墨迹中碱性蓝7的研究报道较少，大部分文献都是在建立墨迹中染料的检测方法时，将碱性蓝7收录在内，用以对圆珠笔或中性笔油墨/墨水进行分类[6-8]。

本研究旨在建立蓝色圆珠笔墨迹中碱性蓝7及其去乙基产物的液相色谱串联质谱方法（LC-MS/MS），考察含碱性蓝7的圆珠笔油墨墨迹在自然光照、氙灯照射和高温条件下，碱性蓝7及其去乙基产物的降解变化，寻找蓝色圆珠笔墨迹中随时间变化的目标物，为进一步研究圆珠笔墨迹的书写时间提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与样品

碱性蓝7购自TCI东京化成工业株式会社；乙腈（色谱纯）购自美国Sigma公司；50%甲酸购自瑞士Fluka公司；无水乙醇为分析纯（宜兴市第二化学试剂厂）。去离子水由Milli-Q超纯水系统制得（美国Millipore公司）。

20mM甲酸缓冲液（pH 4）的配制：称取0.92g 50%的甲酸溶液，用去离子水定容至500mL。

在前期研究的分类基础上[9]，选取碱性蓝7相对含量较高的9种蓝色圆珠笔制作墨迹样品进行老化实验，9种笔的品牌及产地见表1。

表1 9种蓝色圆珠笔品牌及产地

1.2 仪器

Harris micro-punches 0.5mm直径打孔器（美国Sigma-Aldrich公司）。

SUNTEST CPS+文件老化仪（美国Atlas材料测试技术公司），配备波长范围为300～800nm的氙灯。

Waters Acquity超高效液相（美国Waters公司），接API 4000QTRAP四极杆离子阱质谱仪（美国Applied Biosystems公司）。Analyst 1.5软件处理数据（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 样品前处理

用0.5mm直径打孔器在墨迹上打4个孔，将取下的纸片放入0.5 mL Eppendorf管，加100μL乙腈，超声20min。提取溶液用乙腈稀释10倍后，进样5μL。

1.4 LC-MS/MS条件

液相条件：色谱柱为Waters XBridge C18柱（50mm×2.1mm，5μm），前接Waters Acquity在线过滤器（0.2μm，2.1mm），室温。流动相为A（20mM甲酸缓冲溶液）∶B（乙腈）=8∶2（v/v）。

质谱条件：电喷雾电离-正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）模式；离子喷雾电压（IS）：5500 V；离子源温度：500 ℃；碰撞气氮气（CAD）：Medium；气帘气（CUR）：30 psi；离子源气 1（GS1）：40 psi；离子源气 2（GS2）：50 psi。

1.5 碱性蓝7的去乙基产物及其特征性离子对

取碱性蓝7标准品适量，用无水乙醇溶解，涂抹于干净的载玻片上，待溶剂挥发后，将载玻片放入文件老化仪中，以750W/m2的辐照强度照射4h后，取出载玻片，用手术刀片刮下适量样品，用乙腈溶解、稀释。在ESI+模式下，流动注射进样。按照分子量找到碱性蓝7降解产物的分子离子峰（本文中所指碱性蓝7及其去乙基产物的分子离子峰、母离子、子离子均指不含氯离子的阳离子化合物，下同），并进一步获取它们的二级质谱图，以各目标物的分子离子峰为母离子，丰度较强的两个碎片离子为子离子，同时优化去簇电压（DP）和碰撞能量（CE），最终每个目标物选定两对母离子/子离子对，其中第一对离子对用于半定量。

1.6 重现性考察

取5号圆珠笔作为代表，在80g的A4纸（史泰博）上划线，按1.3项下平行制备8份样品。

另用打孔器取样1份，加100μL乙腈，超声20min。然后各取20μL提取溶液，分别用乙腈稀释至100μL、200μL和 400μL。 各进样 5μL进行检测。

1.7 自然光照老化

取9支圆珠笔，在A4纸上划线。一组悬挂于室内朝西方向玻璃窗上，接受自然光照；另一组作为对照，放在室内抽屉中避光保存。制样后即取样（n=2），之后每周取样一次，持续3个月（2010.05.29～2010.08.28）。

1.8 高温老化

取一张A4纸，依次用2号、7号和8号圆珠笔划线，如是制作2张。然后将2张纸各用烘箱避光加热60h，加热温度分别为50℃和100℃。每隔12h取样（n=3），持续 60h。

1.9 氙灯老化

取一张A4纸，依次用2号、7号和8号圆珠笔划线，如是制作6张。然后将6张纸依次放入文件老化仪中各老化 5h，辐照强度分别为 750 W/m2、650 W/m2、550 W/m2、450 W/m2、350 W/m2和 250 W/m2， 老化温度恒定为50℃。老化前和老化后各取一次样（n=3）。

2 结果与讨论

2.1 碱性蓝7及其去乙基产物的特征性离子对

碱性蓝7经过氙灯辐照4h，溶解进样后得到如图2的全扫描质谱图。其中m/z 478是碱性蓝7的[M]+峰，m/z 450、 m/z 422、m/z 394、m/z366 和 m/z 338 等是碱性蓝7的去乙基产物，它们之间分子量的级差为28D a。

图2 碱性蓝7老化4h后的一级全扫描质谱图

对这些离子进一步轰击，获得它们的二级质谱图，根据目标物的碎片离子信息，每个目标物选择两对母离子/子离子对，建立MRM方法。各目标物的LC-MS/MS参数见表2。

为了消除圆珠笔墨迹分布不均对分析结果的影响，本研究采用用相对峰面积来对各组分进行半定量（i表示母离子质荷比为i的目标物，峰面积是指其特征离子对的响应峰面积）。

2.2 重现性考察结果

8份相同浓度的平行样本中碱性蓝7的相对含量值的RSD（相对标准偏差）为0.1%；稀释至三个不同浓度的样品中碱性蓝7的相对含量值的RSD为0.2%，这些结果表明方法能用于分析书写在纸上、油墨分布不均匀的墨迹样品中的目标物。

表2 碱性蓝7及其去乙基产物的LC-MS/MS参数

2.3 自然光照老化结果

经过三个月的自然光照，纸上的蓝色圆珠笔墨迹逐渐褪色。9种圆珠笔油墨中碱性蓝7的降解速度不同：1号至4号、6号和7号6种圆珠笔墨迹中的碱性蓝7的降解速度较为接近；而5号、8号和9号圆珠笔墨迹降解较快。9种圆珠笔墨迹中碱性蓝7的相对峰面积减少了52.9%～97.9%；E4的相对峰面积变化了-1.0%～5.8%；E3的相对峰面积增加了 18.7%～41.7%；E2、E1和E0的相对峰面积分别增加了11.1%～78.5%、1.7%～7.4%、5.1%～14.8%。

2.3.1 碱性蓝7的降解变化

在3个月内，9种圆珠笔墨迹中的碱性蓝7的相对含量随时间逐渐减少。根据SPSS 17.0软件的回归分析结果，7种圆珠笔墨迹中的碱性蓝7老化曲线和指数函数最接近，剩余2种圆珠笔墨迹中的碱性蓝7降解较快，其老化曲线更接近直线（见表3）。

尽管9种圆珠笔的墨迹样品是书写在同一张纸上，且这些油墨中的碱性蓝7具有接近的初始相对峰面积值，但是它们的老化曲线都不相同。这表明碱性蓝7的降解反应会受到圆珠笔油墨配方中其它成分的影响。

值得注意的是1号、2号、3号和4号的拟合曲线非常接近（见图3）。这四种圆珠笔同为丰华牌，只是型号不同，因此它们的油墨配方可能相近。

图3 1号、2号、3号和4号圆珠笔墨迹中碱性蓝7的拟合老化曲线

2.3.2 E4的降解变化

E4丰度最大的子离子是m/z406，但由于m/z450→406的离子对在检测实际老化样品时有干扰峰，所以E4的定量离子对选的是丰度较低、但没有明显干扰峰的m/z450→377。较低的丰度使原本在碱性蓝7降解链中处于上游的E4在定量时所占的相对含量较低。就E4本身来看，在光照条件下，其相对峰面积随时间呈现出先增加后减少的变化趋势。用SPSS 17.0软件进行回归分析，E4随时间变化的趋势最接近二次函数，拟合曲线见表4。1号、2号、3号和4号样品的拟合曲线较为接近。

表3 9种圆珠笔墨迹中碱性蓝7随时间变化的经验公式

2.3.3 E3的降解变化

除了6号和8号样品中的E3在3个月内一直增加以外，其余7种圆珠笔墨迹中的E3的相对含量都先增加后减少。用SPSS 17.0软件进行回归分析，E3随时间变化的趋势最接近二次函数，拟合曲线见表5。1号、2号、3号和4号样品的拟合曲线较为接近。

2.3.4 E2、E1和E0的降解变化

3个月内，E2的相对峰面积持续增加。8号和9号油墨样品的降解较快，它们E2的相对峰面积分别增加至55.8%和78.5%。其余7种油墨样品中E2相对峰面积增加了11.1%～16.7%。

E1和E0是最后两级降解产物，因而出现较晚，对于褪色较快的8号和9号圆珠笔样品，没有检出E1和E0。在检出的所有样品中，这两个降解产物的相对峰面积持续增加，增长范围分别为4.7%～7.4%和5.1%～14.8%。

2.3.5 对照组检测结果

在本实验中，除了自然光照组外，还设置了对照组。对照组样品的分析结果表明，在常温、避光的条件下保存3个月，9种圆珠笔墨迹中的碱性蓝7的相对比例几乎不发生变化，它们相对含量的RSD值均不大于0.3%，表明常温、避光条件下保存的圆珠笔墨迹，其中的碱性蓝7较为稳定。

2.4 高温老化

由于进行自然光照老化实验时，观测到样品周围的最高环境温度约为50℃，为了考察高温对碱性蓝7降解的影响，选取2号、7号和8号圆珠笔分别在50℃和100℃下避光加热60h，检测结果表明：即使在100℃，这些样品中的碱性蓝7降解量也都非常有限：变化最明显的7号样品中碱性蓝7的降解量约为1.6%。该结果说明温度对墨迹中碱性蓝7的降解的影响可以忽略不计。

2.5 氙灯老化

2号、7号和8号圆珠笔墨迹在文件老化仪中用6个不同的辐照强度分别照射5h，各样品中的碱性蓝7都发生降解，而且降解量随辐照能量的增加而增加；与此同时，E4～E2的相对含量不断增加。相比三个月的自然光照老化，氙灯老化的实验条件较为温和，因此无论在老化前还是用750W/m2的最大辐照强度老化5h后，各样品中都没有检出降解产物E1和E0；3种圆珠笔墨迹中E2的相对峰面积分别增加了0.28%、1.19% 、2.91%。3种圆珠笔墨迹中碱性蓝7、E4和E3随辐照能量变化的拟合曲线见表6至表8。

和自然光照老化实验相比，氙灯老化实验中，样品箱内的温度恒定（50℃），总的辐照能量可控，因此得到的老化曲线主要描述了光辐照能量对碱性蓝7降解的影响。2号、7号和8号圆珠笔墨迹中碱性蓝7的老化曲线都可拟合成指数函数，而E4、E3都可拟合成二次函数，这一结论与自然光照老化实验的结论一致。

表4 9种圆珠笔墨迹中E4的老化曲线模型

表5 9种圆珠笔墨迹中E3的老化曲线模型

表6 3种圆珠笔墨迹中碱性蓝7的拟合曲线模型

在碱性蓝7的5个去乙基产物中，只有E4（根据不同的离子源，m/z为450或448）由Ifa,Denman和Gallidabino[6,8,10]报道过，而本研究建立了同时检测碱性蓝7及其5个去乙基产物的MRM方法，为可疑文件上含碱性蓝7的墨迹检验提供了新的鉴别方法，也为进一步研究圆珠笔墨迹中碱性蓝7的降解变化与书写时间的关系提供了基础。

影响染料老化行为的因素很多，如初始的染料浓度、墨水配方、光辐照度和波长，湿度，等各种内外环境因素[12]，通过建立碱性蓝7及其去乙基产物的人工老化曲线，并研究不同的油墨配方和温度的影响，本研究初步刻画了碱性蓝7的降解变化。有关不同贮存条件下碱性蓝7的自然老化过程、碱性蓝7和油墨配方中其它成分之间的具体相互作用等，有待进一步的研究。

表7 3种圆珠笔墨迹中E4的拟合曲线模型

表8 3种圆珠笔墨迹中E3的拟合曲线模型

3 结论

本研究建立了碱性蓝7及其5个去乙基产物的LC-MS/MS方法，通过对9支圆珠笔墨迹样品进行自然光照老化实验，得到：在光照条件下碱性蓝7的相对含量不断下降，其去乙基产物E4和E3的相对含量依次达到峰值后下降，E2、E1和E0的相对含量持续增加。进一步进行氙灯老化实验，结果表明：碱性蓝7的相对含量和光的辐照能量之间成指数函数关系，而其降解产物E4、E3的相对含量和光的辐照能量成二次函数关系。碱性蓝7的降解受油墨配方的影响，而温度的影响可以忽略。

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