隐球菌性脑膜炎患者真菌培养结果分析及潜在意义

成钢卫 罗丽敏 李水彬

隐球菌性脑膜炎患者真菌培养结果分析及潜在意义

成钢卫 罗丽敏 李水彬

目的 探讨真菌培养结果对隐球菌性脑膜炎诊疗的意义。方法 回顾性分析了隐球菌患者的脑脊液培养结果及印度墨汁染色结果, 将两者对照研究。结果 45例隐球菌性脑膜炎患者首次脑脊液培养结果43例阳性, 虽然高于印度墨汁染色38例阳性的结果, 但差异无统计学意义 (χ2=1.975,P= 0.157)；治疗中期脑脊液培养结果30例为阳性, 和印度墨汁染色的结果比较未见差异(χ2=1.661, P=0.195)；首次脑脊液培养结果显示26例患者对氟康唑耐药而未见对两性霉素B耐药者(χ2=33.804, P=0.000);治疗末期脑脊液培养的结果先于印度墨汁染色转阴, 10例印度墨汁染色持续阳性患者, 脑脊液培养转阴患者停药后未见复发[P(1≤X)=0.002] 。结论 脑脊液培养对指导隐球菌脑膜炎患者抗真菌药物的使用有重要的价值, 需高度重视;培养结果可能更适合作为停药的指标之一。

隐球菌性脑膜炎；脑脊液；培养

隐球菌性脑膜炎诊断治疗中仍存在较多的问题：有些患者需反复行脑脊液印度墨汁染色检查才能确诊；有些患者在应用氟康唑的过程中病情出现反复, 甚至出现颅内肉芽肿样病变；有些患者在治疗后期脑脊液印度墨汁染色长期阳性停药困难；诸多问题给新型隐球菌性脑膜炎的治疗带来了更多的困惑。本研究通过对近年来隐球菌性脑膜炎患者脑脊液培养及药敏结果的分析力图找到上述问题的解决办法。

1 资料与方法

1.1 入选标准 2007～2013年入住本院的患者, 患者脑脊液印度墨汁染色或培养结果发现隐球菌。

1.2 一般资料 纳入试验患者45, 其中男性29例, 女性16例；年龄14～63岁, 病程14～60d, 患者表现为不同程度的头痛及或发热, 极个别患者无头痛表现为头晕、共济失调, 体温36.3～39.1℃, 20例存在意识障碍, 死亡27例, 绝大多数患者脑脊液澄清, 脑脊液压力>300 mmH2O,脑脊液蛋白含量及脑脊液白细胞绝大多数轻中度升高,并发疾病有获得性免疫缺陷综合症(AIDS 3例), 2型糖尿病(5例), 系统性红斑狼疮(6例), 皮肤天疱疮(1例), 肝硬化(2例), 恶性肿瘤(3例),肾功能衰竭, 可能病因：长期口服抗生素尤其是某些慢性鼻炎或咽喉炎患者长期局部应用抗生素(8例)；免疫功能缺陷,包括AIDS、恶性肿瘤、风湿免疫类疾病长期应用激素尤其是免疫抑制剂者(15例)；可能密切接触真菌的患者, 例如翻新旧沙发, 居住环境过于阴暗潮湿等(9例)；长期熬夜也可能与发病有关, 原因不明者(13例)。

1.3 研究及分组方法 采用回顾性分析、自身配对分组办法,全部患者均同时行脑脊液的印度墨汁染色及培养, 将全部患者首次的脑脊液印度墨汁染色及培养结果加以比较。将能够坚持抗真菌治疗两周后患者的脑脊液印度墨汁染色及培养结果(31例)加以比较。将治疗末期(两性霉素B脂质体的总用量达到3.0, )18例患者的脑脊液结果加以比较。其中10例患者在导致免疫力减低的因素可控的条件下(如停用抗生素, 避免密切接触真菌及可停用免疫抑制剂者), 在头痛及发热消失、脑脊液压力小于180 mmH2O、脑脊液内白细胞数小于5×106/L 后,在印度墨汁染色仍阳性而培养结果阴性的情况下给与停药。

1.4 治疗方法 首先向患者及家属说明病情及高昂的治疗费用, 如果患者能够承受治疗风险及费用, 立即开始应用国产两性霉素B脂质体, 药物严格按照说明配置, 首次两性霉素B脂质体10 mg+5%葡萄糖注射液500 ml 以50 ml/小时避光持续泵入, 如患者无明显的不适, 此后两性霉素B脂质体50 mg+5%葡萄糖注射液500 ml以 50 ml/h避光持续泵入, 每日液体入量3000 ml以上, 每日补钾10.0 g以上, 每星期复查一次肝肾功能及电解质, 每3天行一次腰椎穿刺术, 根据病情鞘内注射两性霉素B脂质体0.1 mg～0.5 mg, 同时通过缓慢释放脑脊液将患者脑脊液终末压控制在100 mmH2O, 大部分患者合用氟胞嘧啶。

1.5 统计学方法 将每个患者的脑脊液培养、药敏结果、印度墨汁染色结果作为一个统计数据。两组的可比性行配对χ2确切概率法计算；对于10例墨汁染色持续阳性患者停药后的情况使用SPSS 19.0统计软件，行Poisson检验, 假设检验采用双侧检验, 取α=0.05，为检验水准，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

全部新型隐球菌性脑膜炎患者首次脑脊液培养结果43例阳性, 印度墨汁染色阳性者38例, 两者异无统计学意义(见表1)；治疗中期脑脊液培养结果30例为阳性, 和印度墨汁染色的结果比较未见差异(见表2)；首次脑脊液培养结果显示26例患者对氟康唑耐药而未见对两性霉素B耐药者(见表3)；治疗末期脑脊液培养的结果先于印度墨汁染色转阴,10例印度墨汁染色持续阳性患者, 脑脊液培养转阴患者停药后未见复发[P(1≤X)=0.002], 按照文献发病后3个月内60%的死亡率, 10例患者出现一例存活的概率计算。

表2 抗真菌治疗2周后脑脊液墨汁染色和培养结果阳性率的对比(n)

表3 脑脊液培养药敏结果对照(n)

3 讨论

隐球菌脑膜炎是由隐球菌感染引起机会感染性疾病。新生隐球菌有3个变种, 即新生变种(var neoformans)、格特变种(var gattii)和上海变种(shanghaiensis)。隐球菌广泛存在于自然环境中：如鸽粪等鸟类粪便, 腐烂的水果, 植物表面等［1］, 隐球菌性脑膜炎患者通常通过吸入隐球菌的孢子或干燥的真菌细胞进入肺部后继发脑部病变［2］, 个别患者可通过皮肤或消化道感染［1］, 患者多为免疫功能减退患者, 也可发生于健康人［3］。在本研究中8例患者因慢性咽喉炎长期口服并局部喷涂抗生素造成口咽部菌群失调, 上呼吸道的免疫屏障破坏, 给隐球菌进入人体创造了良好的条件, 而且在病因中占很大比例, 值得引起重视［4］。风湿免疫性疾病, 比如系统性红斑狼疮［5］,天疱疮等, 较易并发新型隐球菌性脑膜炎, 机理可能与疾病相关的免疫异常有关, 但和长期应用激素尤其是免疫抑制剂的关系密切。而且本研究中所有患者并无明显的鸽子或禽类接触史, 而有些患者的病因似乎和过于阴湿的居住环境有关。

本研究结果显示初次脑脊液培养结果阳性例数虽然高于印度墨汁染色结果, 但两者差异并无统计学意义, 说明在诊断方面, 脑脊液培养的结果并不明显的优于印度墨汁染色, 这可能也是脑脊液培养在隐球菌脑膜炎的诊疗中不受重视的原因。在治疗两周后30例患者的脑脊液培养结果仍提示阳性, 没有出现细菌学脑膜炎患者在应用抗生素治疗后, 脑脊液培养结果难以培养出细菌的结局。虽然统计学上未显示出与印度墨汁染色结果的差异, 但至少可以说明脑脊液培养结果与印度墨汁染色结果相匹配, 因此推测脑脊液培养结果能够体现体内隐球菌的活力, 可以尝试作为停药的标准。坚持到治疗末期的只有18例患者(大多数患者选择放弃治疗, 除和昂贵的治疗费用关外, 治疗经验和规范的欠缺, 医疗环境的恶化也有重要关系),其中10例患者的脑脊液印度墨汁染色结果长期不转阴, 这10例患者(患者无明显的免疫功能减退或导致免疫功能减退的原因可控)在培养结果转阴, 脑脊液压力及白细胞数正常后给予停药, 患者在随访0.5～6年后未再出现头痛、发热症状, 可以认为是治愈。由于治疗末期病例数太少, 所以使用了泊松分布计算了死亡概率, 计算结果显示这种结果有统计学意义。故对免疫功能正常的患者, 脑脊液培养的结果阴性后, 在患者临床症状消失, 脑脊液压力及白细胞正常后可以停药观察。

本研究培养结果显示26例对氟康唑耐药［6］, 显示出本研究中隐球菌对氟康唑的耐药率明显高于对两性霉素B的耐药率, 目前关于隐球菌耐药问题的研究有很大的差异, 有些研究表明隐球菌对氟康唑的敏感性非常高95.2%［7］, 有些研究显示隐球菌对氟康唑发生耐药的可能性非常大51.6%［8］。所以结合本研究的具体情况, 按照有关文献隐球菌对氟康唑51.6%的耐药率计算, 两性霉素B出现1例耐药的几率也小, 只有假设隐球菌对氟康唑的耐药率10%时, 这种情况才有可能发生, 但在假设10%的氟康唑耐药率的情形下, 本研究中最多出现8例耐药患者, 远高于本研究中26例耐药患者的出现率。而且在临床工作中, 有些患者在应用氟康唑3-7天后头痛有缓解, 但通常两周后又出现难以缓解的头痛, 提示异质性耐药［9］, 即在体外的常规药敏试验中 ,菌株表现为敏感 ;若改用特殊的方法检测 ,则发现细胞的大部分亚群属于敏感 ,但有一小部分亚群属于耐药菌。相关的动物试验也证明：在使用氟康唑14天时, 颅内的真菌含量又复增加, MIC(minimal inhibitory concentrations) 水平明显地升高［10］。另外有些患者应用氟康唑(2～3月)后病情仍难以治愈, 颅内出现肉芽肿样病变[11～12]。所有这些都证明了氟康唑耐药亚群是广泛存在的, 并不像估计的那么乐观。体外培养耐药或存在异质性耐药可能是氟康唑治疗失败的原因, 虽然本研究对隐球菌耐药的机制尚难解释。

鉴于本研究药敏结果, 所以在制定治疗方案时脑脊液培养尤为重要, 根据药敏结果应用抗真菌药物应该成为临床的标准措施;同时对临床症状消失的患者,在印度墨汁染色持续阳性的情况下,脑脊液培养结果阴性患者可以停药观察,因为大部分患者在应用两性霉素B脂质体治疗末期,都会出现不同程度的肝肾损害,继续盲目用药可能造成永久的不可逆转的肝肾损害。

［1］ Negroni R.Cryptococcosis. Clin Dermatol.2012,30(6):599-609.

［2］ Sabiiti W, May RC.Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.Future Microbiol,2012,7(11):1297-313.

［3］ Rocha KC, Pinhal C, Cavalcanti S,et al.Lymphocyte transformation assay for C neoformans antigen is not reliable for detecting cellular impairment in patients with Neurocryptococcosis.BMC Infect Dis,2012 ,30;12(1):278.

［4］ Hosseinnezhad A, Rapose A.Cryptococccal meningoencephalitis after H1N1 influenza.BMJ Case Rep,2012 ,2012.

［5］ Subils GC, Maldonado FS.Cryptococcal meningitis as initial presentation of systemic lupus erythematosus.Rev Fac Cien Med Univ Nac Cordoba,2012 ,69(1):47-50.

［6］ Flores VG, Tovar RM, Zaldivar PG, et al.Meningitis due to Cryptococcus neoformans: treatment with posaconazole.Curr HIV Res,2012 ,10(7):620-3.

［7］ Matos CS, de Souza Andrade A, Oliveira NS,et al.Microbiological characteristics of clinical isolates of Cryptococcus spp.in Bahia,Brazil: molecular types and antifungal susceptibilities.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012,31(7):1647-52.

［8］ Trpkovi A, Pekmezovi M, Bara A,et al.In vitro antifungal activities of amphotericin B, 5-fluorocytosine, fluconazole and itraconazole against Cryptococcus neoformans isolated from cerebrospinal fluid and blood from patients in Serbia.J Mycol Med, 2012, 22(3):243-8.

［9］ Varma A, Kwon-Chung KJ.Heteroresistance of Cryptococcus gattii to fluconazole.Antimicrob Agents Chemother,2010,54(6):2303-11.

［10］ Mendes FE, Oliveira LV, Faria ES,et al.Correlation of the in vitro antifungal drug susceptibility with the in vivo activity of fluconazole in a murine model of cerebral infection caused by Cryptococcus gattii.Eur J Clin Microbiol Infect Dis.2010 ,29(12):1525-32.

［11］ Musubire AK, Meya BD, Mayanja-Kizza H, et al.Challenges in diagnosis and management of Cryptococcal immune reconstitution inflammatory syndrome (IRIS) in resource limited settings.Afr Health Sci,2012,12(2):226-30.

［12］ Inoue A, Harada H, Iwata S, et al. Intraventricular cryptococcoma successfully treated with liposomal amphotericin B and voriconazole: a case report .Curr HIV Res,2012,10(7):620-3.

The Analysis and potentialsignificance of cerebrospinal fluid Culture in patients with cryptococcal meningitis

CHENG Gang-wei , LUO Li-min , LI Shui-bin.
Department of Neurology, People's Hospital of Meizhou City, Meizhou 514031,China

Objective To explore the significance of CSF (cerebralspinal fluid )culture in patients with cryptococcal meningitis.Methods Analysed the cerebrospinal fluid culture results amd India ink stain results of paitients with cryptococal meningitis.Results CSF culture was positive in 43 cases among 45 patients with cryptococcal meningitis in the first time test, higher than that(38) in the India ink stain ,but no statistical difference(χ2=1.975, P= 0.157); CSF culture Results of 30 cases were positive after two weeks treatment, compared with the India ink staining Results showed no difference (χ2=1.661 2, P= 0.195) ; CSF culture showed 26 patients resistant to fluconazole and none resistant to amphotericin B (χ2=33.804 2, P= 0.000); At the end of period of treatment, CSF culture Results turned to negative earlier than that in the India ink staining .10 cases of India ink stain positive patients had no recurrence ,when withdraw antifungal drugs after CSF culture turned to negative [P(1≤X)=0.002].Condlusion We highlight the importance of CSF cultures in guiding treatment decisions in the patients with cryptococcal meningitis.CSF culture may be more reliable as the criterion for stopping treatment .

CSF; Cryptococcal meningitis culture

514031 梅州市人民医院神经内二科

成钢卫 E-mail：chenggangweinan@yahoo.com.cn