Nrf2过表达对乙醇刺激下肝星状细胞激活与增殖及合成I型胶原的影响*

刘 曼， 何 月， 张吉翔

(南昌大学第二附属医院消化内科，江西省分子重点实验室，江西 南昌 330006)

Nrf2过表达对乙醇刺激下肝星状细胞激活与增殖及合成I型胶原的影响*

刘 曼， 何 月， 张吉翔△

(南昌大学第二附属医院消化内科，江西省分子重点实验室，江西 南昌 330006)

目的探讨核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)过表达对乙醇诱导下大鼠肝星状细胞系HSC-T6激活与增殖及I型胶原mRNA及蛋白表达水平的影响。方法采用脂质体介导法对HSC-T6进行pEGFP-Nrf2重组质粒及pEGFP-N1空载质粒瞬时转染，将细胞分为正常对照组、乙醇刺激组、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组和乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组。采用RT-PCR及Western blotting方法对HSC-T6中Nrf2、I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表达水平进行检测，采用MTT法对HSC-T6细胞增殖水平进行检测，采用流式细胞术对HSC-T6细胞周期分布进行检测。结果(1) 荧光显微镜下观察显示pEGFP-Nrf2质粒成功转染HSC-T6，转染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表达水平较其余组显著升高(P<0.05)。(2) 乙醇刺激组与乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组之间细胞增殖水平、I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，均明显高于正常对照组(P<0.05)，细胞周期分布G1期比例下降，S期比例升高(P<0.05)，而乙醇刺激+ pEGFP-Nrf2质粒组细胞增殖水平及I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平与乙醇刺激组及乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组相比均显著下降(P<0.05)，细胞周期分布G1期比例显著上升，S期比例显著下降(P<0.05)，呈G1/S期阻滞。结论Nrf2过表达可显著抑制乙醇对HSC-T6 I型胶原及α-SMA mRNA及蛋白表达的促进作用，使HSC-T6细胞周期发生G1/S期阻滞，抑制乙醇诱导的HSC-T6增殖水平的升高，提示其对乙醇诱导的HSC-T6细胞活化具有负性调控作用。

肝纤维化； 肝星状细胞； 核因子E2相关因子2； I型胶原； α-平滑肌肌动蛋白

氧化应激致肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化是酒精性肝纤维化(alcoholic liver fibrosis，ALF)发生的中心环节[1]。过度摄入的乙醇及其代谢产物是引起肝脏内氧化应激的主要介质，当肝内处于持续氧化应激的环境时，肝星状细胞被激活，表型向肌成纤维样细胞(myofibroblast-like cells)转化，分泌大量细胞外基质(extracellular matrix, ECM)导致肝内基质沉积，最终引起肝纤维化乃至肝硬化[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)作为调节抗氧化应激反应的重要转录因子，可增强细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性[3]。而Nrf2对乙醇诱导下HSCs活化水平的影响，目前国内外尚未见报道。为此，本研究应用体外细胞培养技术，以乙醇刺激HSCs增殖活化，在脂质体介导下瞬时转染Nrf2重组质粒，探讨Nrf2对乙醇诱导下HSCs增殖水平、细胞周期分布及活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、 I型胶原(collagen type I, ColⅠ)mRNA和蛋白表达水平的影响。

材 料 和 方 法

1材料

大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自湘雅细胞库，系SV40转染SD大鼠HSCs而成，具有活化HSCs的表型[4]。pEGFP-Nrf2重组质粒及空载质粒pEGFP-N1合成于Invitrogen(项目编号：KL120712001)。转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen。培养基DMEM购自HyClone。胰蛋白酶和胎牛血清购自Solarbio。TRIzol RNA提取试剂盒和DMSO购自北京全式金生物技术公司。逆转录试剂盒购自TaKaRa。各目的基因引物由上海生工生物工程公司合成。2×Taq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术公司。总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗α-SMA多克隆抗体、兔抗Col I多克隆抗体和鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体购自Proteintech。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗鼠Ⅱ抗购自北京中杉金桥公司。FACSCalibar流式细胞仪为Beckton Dickinson产品。

2方法

2.1HSC-T6细胞的培养及传代 HSC-T6复苏后采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养,置于5% CO2、37 ℃孵箱培养。细胞复苏培养至80%～90%融合度左右进行传代。将浓度为1×108cells/L HSC-T6细胞悬液接种于6孔培养板中，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2孵箱培养24 h后随机分为4组：(1)正常对照组；(2)乙醇刺激组；(3)乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组；(4)乙醇刺激+ pEGFP-N1空质粒组。(2)～(4)组中乙醇终浓度均为100 mmol/L[5]，每组设3复孔。

2.2pEGFP-Nrf2质粒瞬时转染 转染前24 h在不含抗生素的培养基中接种适量细胞使转染时细胞的汇合度达到50%左右。以LipofectamineTM2000作为转染介质，参考LipofectamineTM2000试剂盒说明书，混合转染试剂及质粒再按组加入继续培养4～6 h后弃培养基，更换新鲜无双抗培养基继续培养至48h后收集细胞。

2.3RT-PCR检测pEGFP-Nrf2质粒转染对HSC-T6中Nrf2、α-SMA和Col I mRNA表达的影响 HSC-T6分组处理完成收集细胞后,采用TRIzol试剂进行细胞总RNA提取，紫外分光光度计检测浓度。逆转录为cDNA，以此为模板进行PCR扩增。目的基因引物序列见表1。参照Two-Step RT-PCR试剂盒操作说明书进行RT-PCR，总反应体积50.0 μL，其中2× TransTaqTMHiFi PCR SuperMixⅡ 25.0 μL，ddH2O 21.0 μL，上游引物 1 μL(10.0 μmol/L)，下游引物 1 μL (10.0 μmol/L)，cDNA 2 μL。扩增条件：Nrf2：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 7 min。α-SMA：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，63 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 7 min。Col I：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 7 min。β-actin ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用暗箱式紫外投射仪观察电泳结果并照相。结果用BANDLEAD 3.00软件计算基因相对表达值。实验均重复3次。目的基因相对表达值以目的基因条带/β-actin基因条带的吸光度值进行分析。

表1 引物序列

2.4Western blotting检测pEGFP-Nrf2质粒转染对HSC-T6中Nrf2、α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平的影响 HSC-T6细胞分组处理完成收集细胞后进行细胞总蛋白提取和测定：弃培养基，用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤后消化收集细胞；按照蛋白抽提试剂盒说明书，分别加入蛋白裂解液及抽提试剂，4 ℃离心机离心收集蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度后，取20～40 μg细胞总蛋白经5×上样缓冲液和3%SDS配平蛋白至同体积后进行10%SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉封闭后，分别与Nrf2Ⅰ抗(1∶1 000)、α-SMAⅠ抗(1∶800)、ColⅠⅠ抗(1∶800)和β-actinⅠ抗(1∶1 000)孵育过夜，洗涤后加入相应Ⅱ抗，加入底物化学发光试剂后X胶片曝光，曝光显影的目的条带用Quantity One 4.62处理软件进行半定量分析，以内参照为参考标准计算出目的条带标准化后的吸光度值，以此判断蛋白相对表达量。实验均重复3次。

2.5MTT检测细胞增殖能力 转染前24 h用胰蛋白酶消化收集细胞，以1×104cells/well浓度接种于96孔板中，每组分别接种6个复孔，空白调零孔只加不含细胞的培养基。实验处理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h后弃上清，加入150 μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15 min，酶标仪测定492 nm处各孔的吸光度(A)，计算各组平均值。

2.6流式细胞术检测细胞周期分布 取对数生长期细胞，调整细胞密度并将细胞接种于培养皿中，24 h待细胞贴壁后进行细胞处理。处理完成后消化收集各组细胞，用PBS洗涤细胞1次，再用700 mL/L冷乙醇4 ℃固定过夜。染色前用PBS洗去固定液，按照Cell Cycle Detection Kit 提供的方法加入RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入碘化丙啶4 ℃避光30 min，应用FACSCalibar流式细胞仪分析细胞周期，得出细胞各周期的百分率。

3统计学处理

用SPSS 13.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1pEGFP-Nrf2/N1质粒转染结果

通过LipofectamineTM2000脂质体转染方式将Nrf2重组质粒pEGFP-Nrf2和空质粒pEGFP-N1转染入HSC-T6细胞24 h后，荧光显微镜下可见pEGFP-Nrf2组和pEGFP-N1组均有绿色荧光蛋白表达，见图1。pEGFP-Nrf2质粒转染后HSC-T6细胞内Nrf2蛋白表达水平与对照组相比均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

Figure 1. The green fluorescent protein expression of pEGFP-Nrf2 and pEGFP-N1 under fluorescence microscope(×100).

图1荧光显微镜下观察重组质粒pEGFP-Nrf2及空质粒pEGFP-N1绿色荧光蛋白的表达

Figure 2. Western blotting analysis of Nrf2 protein expression in HSC-T6 cells after plasmid transfection. A：control group; B: pEGFP-Nrf2 group; C: pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图2Westernblotting检测质粒转染后HSC-T6细胞内Nrf2蛋白的表达

2各组细胞内α-SMA和ColⅠmRNA的表达

与空白对照组相比，乙醇刺激组和pEGFP-N1空载质粒+乙醇刺激组α-SMA和ColⅠmRNA表达水平均显著升高(P<0.01)，两组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)，而转染pEGFP-Nrf2质粒+乙醇刺激组α-SMA和ColⅠmRNA表达水平较乙醇刺激组、pEGFP-N1空载质粒+乙醇刺激组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3各组细胞内α-SMA和ColⅠ蛋白的表达

与空白对照组相比，乙醇刺激组和pEGFP-N1空载质粒+乙醇刺激组α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，两组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)，而转染pEGFP-Nrf2质粒+乙醇刺激组α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平较乙醇刺激组和pEGFP-N1空载质粒+乙醇刺激组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

4各组细胞增殖水平比较

乙醇刺激组和乙醇刺激+空载质粒组所测得A值与空白组相比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而这两组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)；乙醇刺激+pEGFP-Nrf2组所测得A值与乙醇刺激组和乙醇刺激+空载质粒组相比显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

Figure 3. Expression levels of Nrf2,α-SMA and ColⅠ mRNA in HSC-T6 cells detected by RT-PCR. M: marker；A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

图3RT-PCR检测HCS-T6细胞Nrf2、α-SMA和Col1mRNA的表达

5各组细胞周期分布情况

与空白对照组细胞相比，乙醇刺激组和乙醇刺激+空载质粒组G1期细胞比例下降，S期细胞比例上升，差异有统计学意义(P<0.05)，而这两组之间各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)；pEGFP-Nrf2转染+乙醇刺激组所测得细胞G1期比例较乙醇刺激组和乙醇刺激+空载质粒组显著升高，而S期细胞比例显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示Nrf2过表达可使乙醇刺激下的HSC-T6细胞发生G1/S期阻滞。各组G2期细胞比例相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

Figure 4. The expression of Nrf2,α-SMA and Col I proteins. A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

图4Nrf2、α-SMA及ColI蛋白的表达

表2各组细胞增殖水平比较

Table 2. Comparison of the cell proliferation among the four groups(Mean±SD.n=6)

GroupAvalueControl0.533±0.128Ethanol1.219±0.157*Ethanol+pEGFP-Nrf20.828±0.124#Ethanol+pEGFP-N11.241±0.143*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group or ethanol+pEGFP-N1 group.

讨 论

酒精性肝纤维化是长期过量饮酒导致的一种慢性肝脏疾病，最初表现为酒精性脂肪肝，进而发展为酒精性肝炎、肝纤维化乃至肝硬化[6]。酒精性肝病是欧美国家人群中慢性肝病的主要原因[7]，近年来在我国发病率也呈现上升趋势[8]，严重威胁国民健康。目前认为，肝纤维化是酒精性肝病发病过程中的转折点，在此阶段如能及时去除导致肝纤维化的不利因素有可能中止肝纤维化的进程甚至使病变向良性方面转归[9]。因此，对酒精性肝纤维化的发病机制及治疗靶点的研究势在必行。

过度摄入的乙醇及其代谢产物攻击细胞膜产生大量活性氧促发脂质过氧化酶链式反应并导致过氧化产物大量堆积，由此引起肝脏内持续氧化应激状态，可直接攻击HSCs促其活化，也可通过诱导NF-κB、AP-1和MAPK等炎症信号通路活化，导致肝Kupffer细胞激活并进一步分泌大量细胞因子如转化生长因子 β(transforming growth factor β,TGF-β)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF) 等进而激活HSCs[1]。HSCs活化后表型向肌成纤维样细胞转化，细胞增殖水平升高，表达其活化标志蛋白α-SMA,分泌大量细胞因子及以Col I为主的细胞外基质导致肝内基质沉积，最终引起肝纤维化乃至肝硬化[10]。因此，抑制乙醇及其代谢产物导致的肝内氧化应激水平对于逆转乙醇诱导的HSCs活化及肝纤维化进展具有重要意义。

Nrf2属于碱性亮氨酸拉链蛋白家族(basic leucine-zipper,bZIP)中调节抗氧化应激反应的重要转录因子[11]。通常情况下，Nrf2与其特异性受体Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)偶联结合于胞浆而使Nrf2活性处于相对抑制状态。Keap1是一个富含巯基的蛋白，在接受细胞外信号如氧化应激等刺激后，Keap1巯基交联并发生构型转变，导致Nrf2与Keap1解偶联因此活化并发生核转移。Nrf2进入核内与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合，启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表达，包括血红素氧合酶1、NAD(P)H:醌氧化还原酶1、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等，增强细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性。Nrf2 -Keap1抗氧化系统与疾病的关系是近几年的研究热点，在预防肺纤维化、糖尿病、神经系统疾病等方面均有报道[12-14]，近年研究认为Nrf2对各类肝脏疾病也具有重要保护作用[15]。Wu等[3]提出，Nrf2活化对乙醇诱导的肝内氧化应激及肝脏损伤具有重要保护作用，然而该研究并未在细胞水平研究Nrf2对HSCs活化的影响。此外，Oh等[16]研究发现，萝卜硫素可通过活化Nrf2而抑制促纤维化信号通路TGF-β/Smad活性，提示Nrf2在抑制肝纤维化进展中发挥重要作用。然而，上述研究均未靶向HSCs研究Nrf2过表达对乙醇诱导下HSCs活化情况的影响。本研究通过脂质体瞬时转染Nrf2重组质粒上调Nrf2表达，观察Nrf2过表达对乙醇诱导下HSC-T6细胞增殖水平及α-SMA、Col I表达的影响。实验结果表明，pEGFP-Nrf2成功转染HSC-T6细胞，可有效过表达Nrf2；与空白对照组相比，乙醇刺激可显著升高HSC-T6细胞增殖水平并促进α-SMA、ColⅠmRNA及蛋白表达，而在乙醇刺激的基础上转染pEGFP-Nrf2使Nrf2过表达，可显著抑制乙醇刺激引起的HSC-T6细胞增殖水平及α-SMA、ColⅠ表达的升高。

Figure 5. Flow cytometric analysis of cell cycle. A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

图5流式细胞术检测细胞周期

既往研究表明，Nrf2在细胞周期调控中发挥重要作用[17-18]，然而针对HSCs研究Nrf2对乙醇刺激下HSCs细胞周期分布的影响目前尚无人研究。为探讨Nrf2是否通过影响HSCs细胞周期分布进而调控HSCs增殖活化，本实验采用流式细胞术检测，发现pEGFP-Nrf2转染+乙醇刺激组细胞G1期比例较乙醇刺激组与乙醇刺激+空载质粒组显著升高，而S期细胞比例显著下降，细胞周期分布呈现G1/S期阻滞现象。推测其原因，Nrf2可能通过抑制乙醇刺激下HSCs的氧化应激水平进而影响细胞周期分布，也可能直接参与细胞周期蛋白的调控，因此进一步探究Nrf2对HSCs中细胞周期调控蛋白的影响也许能为Nrf2调控乙醇诱导的HSCs活化的研究领域提供新思路。

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EffectsofNrf2overexpressiononproliferation,activationandcollagentypeIsynthesisinculturedhepaticstellatecellsstimulatedbyethanol

LIU Man, HE Yue, ZHANG Ji-xiang

(DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospital,JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:jixiangz@tom.com)

AIM: To investigate the effects of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) overexpression on the proliferation, cell cycle distribution, collagen type I (Col I) synthesis and alpha-smooth muscle actin (α-SMA) expression in cultured hepatic stellate cell line HSC-T6 stimulated by ethanol.METHODSCultured HSC-T6 cells were transfected with pEGFP-Nrf2 or pEGFP-N1 (empty vector) plasmid by liposome transient transfection. The cells were divided into control group, ethanol group, ethanol+pEGFP-Nrf2 group and ethanol+pEGFP-N1 group. The mRNA expression of Nrf2, α-SMA and Col I was determined by RT-PCR, and their protein expression was detected by Western blotting. Cell proliferation was assessed by MTT assay, and cell cycle was detected by flow cytometry.RESULTSThe pEGFP-Nrf2 plasmid was successfully transfected into HSC-T6 cells, and the mRNA and protein expression of Nrf2 was higher than other three groups 48 h after transfection (P<0.05). Compared with control group, the cell proliferation and the mRNA and protein expression of α-SMA and Col I in ethanol group and ethanol+pEGFP-N1 group were significantly increased (P<0.05), and the numbers of HSC-T6 cells were decreased in G1phase and increased in S phase (P<0.05), without significant differences between the two groups (P>0.05). Meanwhile, the cells in ethanol+pEGFP-Nrf2 group showed significantly decreased proliferation level, down-regulated mRNA and protein expression of α-SMA and Col I, higher numbers in G1phase and lower numbers in S phase compared with ethanol group and ethanol+pEGFP-N1 group (P<0.05).CONCLUSIONNrf2 overexpression could significantly down-regulate the expression of α-SMA and Col I and cause G1/S phase arrest in HSC-T6 cells cultured with ethanol, thus inhibiting the proliferation and activation of the cells.

Liver fibrosis; Hepatic stellate cells; Nuclear factor E2-related factor 2; Collagen type I; Alpha-smooth muscle actin

R365; R575.2

A

1000- 4718(2013)09- 1590- 07

2013- 04- 01

2013- 07- 18

国家自然科学基金资助项目(No.30360037)

△通讯作者 Tel: 0791-86261633; E-mail: jixiangz@tom.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.009