氮离子注入小扁豆的诱变效应

韩云丽，陈喜明，高克昌，程 丹

（山西省农业科学院玉米研究所，山西忻州034000）

1986年中国科学院等离子体物理研究所的余增亮发现离子束注入水稻的生物学效应，为离子束生物工程的兴起揭开了序幕。其作用机理是将离子注入作物种胚和生长点，通过能量输入、动能传递、粒子植入、电荷交换，诱导作物发生可遗传变异[1]。

目前，离子注入已被广泛应用于作物品种的选育与改良，并在转基因及远缘杂交上得到应用[2-6]。刘志生等[7]利用2.0 MeV氦离子注入获得了比玉米自交系478早熟23 d的自交系和籽粒产量特高的自交系。李玉峰等[8]对N+注入介导大豆基因组DNA转入紫花苜蓿进行了初步研究，结果表明，M2总性状突变率达到19.8%，并得到3株叶片粗蛋白含量比对照高约0.5%的突变株、1株叶绿素含量比对照高33.3%的突变株。

离子注入技术应用于作物领域，具有损伤轻、突变率高和突变谱广等特点，并已被大量试验证明。但多项研究表明，诱变剂量、不同的作物以及同一作物的不同品种对诱变的响应不尽相同[9-15]。小扁豆（Lens calinaris Medik，2n＝2x＝14）又名冰豆、鸡眼豆等，是世界上第7大食用豆类作物，抗寒、耐旱，在我国北方地区有较悠久的种植历史。近年来，随着种植业结构的调整、人们膳食结构的改变，小扁豆以其重要的食疗保健作用倍受青睐，与之相关的育种技术也正受到育种家的关注，但与育种相关的种质资源狭窄问题一直是制约育种发展的瓶颈。离子注入小扁豆的研究报道甚少，尚未见有N+注入小扁豆的研究。

本试验对不同剂量N+注入小扁豆的诱变效应进行了研究，将对小扁豆种质的创新及新品种选育具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 植物材料和辐射处理

LD40，LD56这2个小扁豆品系是分别从地方品种右玉小扁豆和宁武小扁豆中单株连续定向选育的新品系，均由山西省农业科学院玉米研究所小杂豆课题组育成。试验从这2个品系风干种子中分别挑选其大小均匀、籽粒饱满、无破损、无霉菌污染的籽粒作为试样。部分试样留存作为空白对照，剩余种子于2010年4月在山西省农业科学院旱地农业研究中心经能量为60 keV的N+注入，注入剂量分别为 2.0×1016，4.0×1016，6.0×1016，8.0×1016，1.0×1017N+/cm2。

1.2 试验方法

2010年4月22日，把经各剂量N+注入的种子及未注入N+的种子共12份材料播种于大田。每次处理均取300粒种子，随机区组设计，3次重复，每小区5行，行长1 m，行距33 cm，共36个小区。调查M1出苗率，筛选出明显的变异单株（指2个或2个以上性状发生变异的单株，考察性状主要有株高、单株分枝数、花色、单株荚数、生育期和单株产量）。

2011年4月20日，将M1筛选出的明显变异单株分别种成株系，并从上代无表型变异的混收材料中随机抽取100粒种植2行，以观察后代变异情况。突变频率用出现的突变株占观察总个体数的比例来估算。

1.3 数据处理

利用DPS 6.50数据处理系统对试验数据进行线性回归和多重比较，其中，多重比较中，用A～E表示0.01水平上的差异显著情况。

2 结果与分析

2.1 N+注入对小扁豆出苗率的影响

由表1可知，LD40，LD56这2个小扁豆品系的对照出苗率分别为94.1%和90.3%；与对照相比，不同剂量N+注入对2个小扁豆品系出苗率均出现诱变效应，且诱变效应基本一致，2.0×1016，4.0×1016N+/cm2剂量对小扁豆的出苗率有一定的提升作用，但与对照相比差异不显著，且2个剂量间差异不显著；6.0×1016，8.0×1016，1.0×1017N+/cm2这 3 个 N+离子注入剂量中，随着剂量的逐步增加，小扁豆出苗率直线下降，LD40，LD56的出苗率3个剂量依次下降为75.1%，62.3%，42.8%和74.0%，61.3%，40.7%。多重比较表明，这3个剂量处理与对照间差异极显著，且3个剂量间差异也达极显著水平。适当的注入剂量可以促进不同品种小扁豆田间出苗。

表1 N+注入对小扁豆出苗率的影响

2.2 N+注入小扁豆引发的遗传变异情况

表2为N+注入不同剂量处理对2个小扁豆品系M1田间变异统计。

表2 N+注入田间小扁豆变异株统计及多重比较

根据小扁豆株高、单株分枝数、花色、单株荚数、生育期和单株产量等主要性状，筛选出的2个或2个以上性状发生变异的单株确认为是明显变异的单株，结果表明，不同处理的2个品系当代的田间观察中均发现变异株。变异主要表现在叶片变厚、变大，叶面皱缩，豆荚变长变短，茎秆出现畸形，熟期变晚等性状。并随着N+剂量的加大，各品系变异株率呈现增加的趋势。多重比较结果表明，品系内各剂量处理间的变异株率差异极显著，2个小扁豆品系间的变异株率差异极显著。

对不同剂量处理的2个品系M2田间观察显示，有些植株当代出现的变异在M2出现分离，也有些植株虽在诱变当代出现变异但在下一代又恢复了原来品种的特征特性，可能原因是作物自身的调节能力对外界的伤害有一定的修复功能；M2有些植株仍然保持M1的变异性状，说明诱变当代产生的表型变异在后代是部分遗传的。

3 讨论

孙兰弟等[16]对不同剂量的C+辐照小扁豆进行了研究，结果表明，辐射后小扁豆M1不同剂量下的出苗率和对照间相差很小，但90 Gy剂量辐照有利于其生长；M2发芽率降低，30 Gy剂量辐射长势较好。本试验低剂量N+间小扁豆出苗率差异不显著，而高剂量N+间小扁豆出苗率差异极显著。这可能是由不同N+注入及其剂量高低对同一作物的响应不同所致。试验中各处理间出苗率的差异可能主要由诱变处理与品种的不同基因型互作所致。

陈冬花等[17]对拟南芥种子引起M1和M2变异的遗传分析认为，N+注入剂量在5×1013～5×1015N+/cm2范围内，DNA的变异频率随着剂量的增加呈明显的上升趋势，与本试验不同剂量N+对小扁豆变异的诱变效果基本一致。

低剂量处理虽能保持或提高种子的发芽率，但创造的变异有限；而为提高诱变变异效果，加大诱变剂量又会使诱变过程中种皮受损严重，这可能是导致诱变处理后出苗率较低的重要原因之一。

适宜的诱变剂量既能保证足够的植株成活率，又能诱发出较多的突变类型和较高的突变频率，是植物辐射诱变育种成功的关键因素之一。预测适宜辐射诱变剂量的方法有LD50（半致死剂量）、HD50（半致矮剂量）和VID50（活力指数下降50%的剂量）等，但一般以LD50作为辐射育种中适宜诱变剂量的参考[18-21]。本试验仅对小扁豆的N+注入诱变效应进行初步研究，如对HD50进行研究或分析，可得出N+注入小扁豆的最佳辐射剂量，这还有待进一步研究。

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