紫花苜蓿高效遗传转化受体系统的建立

王文斌，王 琳

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

紫花苜蓿是世界上种植面积最大，应用最为广泛的豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，产业化市场前景广阔[1-3]。其不仅富含蛋白质、多种维生素和矿物质[4-6]，而且其发达的根系还具有防风固沙和保持水土等重要的生态功能[7-8]。但是干旱、盐渍等多种逆境限制了它的推广和应用。

国内外已有将外源基因导入紫花苜蓿获得再生植株的报道，而异源目的基因的高效遗传转化有赖于植物高频再生体系的建立[9-10]。在植物遗传转化的研究中，通过愈伤组织再生植株的方法，有利于保持原有品种的优良性状，再通过转移控制特定性状的目的基因，从而达到改良其品质或其他特性的目的。

本试验以新疆大叶和新牧一号苜蓿下胚轴、子叶为材料，研究不同基因型、外植体、培养基及激素配比对其愈伤组织诱导和分化的影响，旨在建立针对这2个品种的高频转化受体系统，为苜蓿的遗传转化奠定坚实的基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试紫花苜蓿品种为新疆大叶（Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye）、新牧一号（Medicago sativa L.cv.Xinmu No.1），均由新疆农业大学草业工程学院张博教授惠赠。试验采用5 d苗龄的紫花苜蓿无菌苗子叶和下胚轴为外植体。

1.2 主要试剂及培养基

1.2.1 主要试剂 SH盐，使用浓度为3183.25mg/L；SH维生素，使用浓度为1 010.5 mg/L；MS，含MS盐和维生素，使用浓度为 4 405.19 mg/L；2，4-D，用少量95%乙醇溶解后加蒸馏水配制成1 mg/mL贮备液，4℃保存；KT，BAP，NAA，IBA，分别用少量 1 mol/L KOH溶解后加蒸馏水配制成1 mg/mL贮备液，4℃保存；以上试剂均购自Sigma公司。

1.2.2 基本培养基 试验以MS（含MS盐和MS维生素）和SH（含SH盐和SH维生素）为基本培养基；进行愈伤诱导、分化和生根时，分别添加不同浓度的植物生长激素和细胞分裂素，附加30 g/L蔗糖、7 g/L植物琼脂；1/2 MS培养基中，MS成分减少1/2，其他成分不变。所有培养基的pH值均为5.7，121℃高压灭菌15 min，分装备用。

1.3 试验方法

1.3.1 种子消毒及无菌苗培养 选取籽粒饱满种子，简单冲洗1 min，转入无菌离心管，每管约为100粒种子，70%酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次；然后在0.5%NaClO中消毒5 min，再用无菌水冲洗7～8次。接种于无激素的1/2 MS培养基，封口膜密封，（25±2）℃暗培养 2 d，再于（25±2）℃、光强150 μmol/（m2·s）及16 h/8 h光周期条件下培养3 d。

1.3.2 愈伤组织诱导 选取5 d苗龄的健康幼苗，分别切取下胚轴（下胚轴切成0.5 cm左右的小段）和子叶（子叶沿靠近子叶柄的部位横切，去距叶柄叶面积的1/3，余2/3面积的子叶），作为愈伤诱导的外植体，分别接种于不同愈伤诱导培养基。供试培养基及激素配比为：MS＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；SH＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；MS＋2 mg/L 2，4-D ＋1 mg/L BAP＋4 mg/L NAA[11-12]。每 90 mm（直径）×15 mm（高）的培养皿接种20块，每种外植体、每个激素水平设置80～100块，16 h/8 h光周期培养，温度（25±2）℃、光强150 μmol/（m2·s）。每隔2周继代培养一次，继代培养基同愈伤诱导培养基。诱导4周后，观察愈伤组织生长状况，并统计出愈数，计算出愈率。

1.3.3 愈伤组织分化 下胚轴经愈伤诱导培养4周后，按愈伤组织的不同来源，各取60～80块，分别接入MS和SH（均添加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）芽分化培养基，每100 mm（直径）×40 mm（高）的培养皿接种10块，16 h/8 h光周期培养，（25±2）℃、光强150 μmol/（m2·s）。每2周继代培养一次，继代培养基同芽分化培养基。诱导8周后，统计再生芽的愈伤组织数，计算分化率。

1.3.4 根的诱导 不同来源的愈伤组织在芽分化培养基上诱导30～50 d后可生成芽，待无根小苗长至2～3 cm时，从基部切下，移入1/2 MS或1/2 MS＋1 mg/L IBA生根培养基上进行根的诱导，每100 mm（直径）×40 mm（高）的培养皿接种10个，培养条件同芽分化，观察并统计生根情况。

1.3.5 扩繁及移栽 再生苗的扩繁培养基与生根培养基相同，切取抗性苗顶芽或带1个腋芽的茎段接入扩繁培养基，培养条件同芽分化。观察并统计生根情况。当再生的小植株出现3条以上健壮根时，稍打开培养皿盖，室内锻炼1～2 d后再将幼苗从培养皿中取出，小心用流水冲净根部附着的培养基，移栽于盛有花土的小花盆中，花土需经浸水过夜。最初3～5 d，盛装小花盆的容器可遮上塑料薄膜以保持湿度，当小苗长出健壮茎叶时，可将其移入大花盆中。

1.4 测定项目及方法

出愈率＝产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100%；分化率＝分化出芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100%；生根率＝生根的植株数/接种的无根小苗数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对愈伤诱导的影响

试验首先以新疆大叶下胚轴为材料，研究不同的基本培养基对愈伤诱导的影响，结果表明，接种到MS培养基（含2 mg/L 2，4-D）上培养4周后，出愈率达86.5%；而接种到SH培养基（含2 mg/L 2，4-D）上时，愈伤组织开始发生的时间相对较迟，但最终出愈率为83.5%，与在MS培养基上培养之间无明显差异。

2.2 不同基因型、外植体和激素配比对愈伤诱导及其生长状况的影响

从表1可以看出，在MS并附加各种激素的培养基上，无论对于下胚轴还是子叶外植体，2种基因型苜蓿间出愈率均没有明显差异；而在SH培养基上，新牧一号下胚轴和子叶的出愈率均高于新疆大叶，但基因型间愈伤组织的形态特征及生长速率没有明显差别。

激素配比对愈伤组织诱导影响较大。在MS和SH这2种培养基上，KT浓度为0.2 mg/L时，出愈率达到最大，下胚轴出愈率92.7%～98.5%，子叶出愈率80.4%～85.6%。在含2 mg/L 2，4-D，1.0 mg/L BAP和4.0 mg/L NAA的MS培养基上，下胚轴和子叶的出愈率明显小于在MS或SH培养基上附加0.2 mg/L KT时的出愈率，愈伤组织呈黄色团块状，质地坚硬。下胚轴和子叶不同外植体在相同培养条件下的愈伤组织诱导率差异较为明显。在各种培养基及激素配比下，下胚轴愈伤启动时间短，在第3～5天时，就开始有愈伤组织形成，而子叶最早要到第7天，而且下胚轴的出愈率明显高于子叶。

表1 不同基因型、外植体和激素配比对愈伤诱导的影响

综合评价，MS＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT 培养基适用于新疆大叶下胚轴和子叶的愈伤诱导，SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT适用于新牧一号。

2.3 不同愈伤组织来源及培养基对愈伤组织分化的影响

为了进一步比较不同培养基、激素及基因型对下胚轴外植体再生的影响，选择了4个试验组合（表2）分析其再生率。

表2 不同的培养基组合

从MS和SH（均附加2 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L KT）培养基中分别挑选不同基因型下胚轴来源的新鲜淡绿色愈伤组织，接种到MS和SH（附加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）的培养基上，进行愈伤组织的分化培养。在2种培养基上培养1周后，愈伤组织表面均开始出现绿色芽点（图1-A），并逐渐转变为成熟的胚状体（图1-B，C）。继续培养4～6周后，部分愈伤组织分化出芽（图1-D）。

从分化培养8周后统计的分化率结果（表3）可以看出，相同来源的愈伤组织在MS培养基上的分化率均高于SH培养基，表明培养基类型对愈伤组织的分化影响较大，添加1 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA的MS培养基更加适宜不定芽诱导。

表3 不同基因型下胚轴在不同组合条件中的再生率

2.4 生根、扩繁及移栽情况

在愈伤组织分化诱导培养基上培养30～50 d后，将长至2～3 cm的再生芽从愈伤组织基部切下，转入不含激素的1/2 MS培养基，7～10 d即可生根，生根率达100%。选取抗性苗顶芽或带1个腋芽的茎段接入不含激素的1/2 MS培养基诱导生根，结果发现，在扩繁培养第2代后，生根过程明显推迟至第15～20天，而且多为短而粗的主根，很少出现不定根。为此，向1/2 MS培养基中添加1 mg/L IBA，生根过程略有提前，并有不定根形成（图1-E）。将出现3条以上健壮根的再生小植株经室内锻炼后移入小花盆（图1-F），成苗率达100%。

2.5 不同培养基及激素组合下植株的比较

由表3还可知，对于新疆大叶而言，尽管组合Ⅰ，Ⅱ中的出愈率略高于组合Ⅲ，Ⅳ，但分化率明显降低，并由此导致再生率降低，下胚轴再生率最高的为组合Ⅲ，达46.54%；而新牧一号下胚轴在组合Ⅲ，Ⅳ中的出愈率及分化率均高于组合Ⅰ，Ⅱ，所以再生率也显著提高，其中组合Ⅲ的再生率达54.96%。

3 讨论与结论

多数研究认为，基因型对苜蓿的再生能力影响较大。马海燕等[13]研究表明，以下胚轴为外植体，在MS＋2 mg/L 2，4-D＋2 mg/L NAA＋1 mg/L KT 培养基上培养2周内，新疆大叶和新牧一号的出愈率均达92%以上，且新疆大叶略优于新牧一号；至4周时，二者愈伤诱导无显著差别，在附加15 mg/L GSH＋6 mg/L ABA的MS分化培养基上，新疆大叶的分化率高于新牧一号。而兰研[14]的研究则认为，以叶片为外植体，在同样的培养基上新疆大叶出愈率较新牧一号高，但在MS＋4 mg/L KT的分化培养基上，新牧一号的绿点率及成苗率高于新疆大叶。可见，不能简单判断二者再生能力的大小，所谓再生能力的强弱是基于其所处的培养条件。本试验中，尽管新疆大叶和新牧一号的再生能力也存在一定差异，如在SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT培养基上新疆大叶的出愈率略高于新牧一号，而在其他培养基上新牧一号则高于新疆大叶，但差异不显著，2种基因型下胚轴来源的愈伤组织的分化能力也无明显差异。由此可见，在本试验中，基因型对苜蓿的再生能力并没有显著影响，但需要说明的是，这个结论的得出基于试验中所采用的相同的外植体、培养基类型及激素配比这个前提条件。

在植物离体培养的过程中，外植体的内源激素水平不断变化，在培养基中添加不同种类、不同浓度的生长调节物质可以影响内源激素的水平，从而影响外植体的生长状况，控制细胞脱分化和形态建成[15]。一些试验结果显示，低浓度的细胞分裂素能够提高愈伤组织的诱导率[16]。在本试验中，也得到了类似的结果，在愈伤组织的培养阶段，KT能辅助2，4-D发挥更好的效果，0.2 mg/L是KT对于下胚轴愈伤组织诱导及生长最适宜的浓度，过高浓度的KT反而会降低愈伤组织的诱导率。这也与潘竞丽等[16]的研究以及王涌鑫等[17]对保定苜蓿的研究结果相一致。但肖燕等[12]以2mg/L2，4-D＋1mg/L BAP＋4 mg/L NAA的激素配比成功从新疆大叶和新牧一号下胚轴诱导出愈伤组织，且培养4周时出愈率达100%；而本试验中尽管通过该培养基也诱导出愈伤组织，但出愈率较低，最高出愈率仅为86.7%，愈伤组织状况也不如附加2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT的培养基，这可能是由于试剂不同所造成的，具体的原因还有待进一步分析。借鉴马晖玲等[18]的研究，本试验中愈伤组织在含1.0mg/LBAP和0.3 mg/L NAA的培养基上也成功分化出芽，且分化率最高达到55.8%。

几乎苜蓿所有器官或组织都可以作为外植体，但对于不同的基因型、在不同的培养条件下，合适的外植体选择也是决定再生体系成功的一个关键因素。近年来，在紫花苜蓿再生体系建立的研究中，子叶和下胚轴是较常用的外植体[12，19-21]，且下胚轴的愈伤诱导率高于子叶。本试验结果也表明，无论是对于不同的基因型，还是不同的培养基、不同浓度的KT，下胚轴的愈伤诱导率均明显高于子叶，下胚轴最高出愈率达98.5%，子叶最高为85.6%，而且下胚轴愈伤启动时间短，愈伤质量较好。

愈伤组织的诱导和分化对培养基的需求是不同的。在愈伤组织诱导阶段，新疆大叶在MS培养基上的出愈率略优于SH培养基，新牧一号则相反，但是愈伤组织的分化率结果证明，来源于SH培养基的愈伤组织分化能力要明显高于MS培养基。在愈伤组织分化阶段，含相同激素的MS分化培养基要优于SH培养基。受不同培养基的影响，植株的再生率也出现显著差异。由此可见，对于2种苜蓿而言，SH更加适宜愈伤组织的诱导，而MS培养基更利于愈伤组织的分化。

综上所述，适用于2种苜蓿愈伤组织诱导、分化及生根培养的培养基分别为SH（附加2 mg/L 2，4-D 和 0.2 mg/L KT），MS（附加 1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）和 1/2 MS（扩繁时附加 1 mg/L IBA）。

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