针刺激活下丘脑室旁核神经元的特异性研究

张娇娇，王少军，谭连红，朱 兵，王朝辉

(1.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700;2.长春中医药大学针灸推拿学院，长春 130117)

下丘脑室旁核(Paraventricular nucleus，PVN)是含有分泌应激激素的主要核团，其中室旁核小细胞亚核含有众多的促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin Releasing Hormone，CRH)、神经元、脑啡肽、促甲状腺释放激素神经元等。这些激素通过下丘脑-垂体轴形成了应激反应的主要成分［1］。当应激源到达下丘脑的 PVN时，CRH神经元合成并释放CRH到达腺垂体，刺激垂体分泌促肾上腺皮质激素(AdrenocorticotropicHormone，ACTH)，ACTH 随血液循环而作用于肾上腺，促使肾上腺皮质合成和分泌糖皮质激素。糖皮质激素能通过负反馈作用，调节下丘脑、海马和其他边缘系统结构，影响觉醒、认知、情感等功能。

本研究通过“在体”记录下丘脑室旁核热刺激(一种应激刺激)及氢化可的松(一种糖皮质激素)敏感神经元，并以该神经元放电为指标，观察针刺不同部位的20个穴位对该神经元激活效应及强度差异，遴选这种效应的特异性相关穴位，并进一部验证特异性相关穴位对外周血皮质酮水平的影响，以探讨针刺调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能的穴位特异性，为临床针灸调节机体内环境平衡、增强对外界变化适应能力的选穴提供理论依据。

1 方法

1.1 雄性成年

Sprague-Dawley大鼠，体质量 240～280g，由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供(SCSK-2002-0016)，为普通级动物。标准啮齿类动物饲料分笼喂养，室温20±2℃，光照12h。实验动物的使用严格遵守实验动物的管理及伦理委员会的规定。

造模:10%乌拉坦麻醉(腹腔注射1.1ml/100g)。右侧颈部剪毛，碘酒、酒精消毒后沿颈静脉走行剪开颈部皮肤(＜1cm)，分离颈静脉至远心端及远心端分支处，于远心端套线(4-0)牵拉颈静脉，用细塑料管(Φ0.2 cm)缓慢插入颈静脉向心端，固定，观察无渗血后4-0线缝合切口。细塑料管另一端与三通相连，分别与1%肝素及氢化可的松注射液(先用无水乙醇配成浓缩液，使用时再用0.9%生理盐水稀释，10mg/kg静脉注射)［2］相连。全部操作均在无菌条件下进行。

在上述手术完成之后，将大鼠移至 KOPF-900型大鼠立体定位仪上，呈俯卧位，双耳用耳棒固定，上齿钩挂在鼠头夹中，口鼻部用鼠头夹夹紧。于颅正中线纵向切开皮肤，分离切除皮下组织，去除骨膜暴露出前后囟，将前后囟调至同一水平面。参照大鼠脑图谱(Paxions和 Watson，2006)标定下丘脑室旁核在颅骨二维坐标的位置:后囟前6.9～7.4mm，旁开约0.4～0.9mm。在此范围中央先用颅骨钻钻开一小孔，再用咬骨钳沿钻开的小孔小心地剔除约5×3mm2的颅顶骨，然后在显微镜下用游丝镊去除脑膜。

1.2 单细胞活动的细胞外记录

采用充灌1%滂胺天蓝的玻璃微电极(尖端小于0.5μm，阻抗为15～20 MΩ)，在液压微电极操纵器(SM-25C日本)控制下根据室旁核的三维空间坐标定位(后囟前6.9～7.4mm，旁开约0.4～0.9mm，深度约前后囟水平下7.6～8.6mm)，将记录微电极插入室旁核，当记录微电极在下丘脑室旁核记录到神经元电活动时分别进行以下操作:48℃热水浸烫大鼠2/3尾巴，如果神经元电活动增强(≥20%)，为下丘脑室旁核热刺激敏感神经元。将热水移开，待神经元电活动恢复到接近基础放电水平，给以静脉注射氢化可的松(Sigma，先用无水乙醇配成浓缩液，使用时再用0.9%生理盐水稀释，10mg/kg静脉注射)［2］，如果神经元电活动抑制(≥20%)，待神经元电活动恢复到接近基础放电后，分别注射睾酮8mg/kg(Sigma)［3］、雌 激 素 (Sigma，30 ～ 50ng/kg)［4］。对热刺激增强、静脉注射氢化可的松抑制、睾酮轻微抑制、雌激素无反应的神经元为下丘脑室旁核热刺激氢化可的松敏感神经元。

以该神经元放电为指标，分别观察针刺不同部位20个穴位对该神经元的激活效应及强度的差异，遴选针刺激活该神经元的特异性相关穴位。不同穴位的刺激要间隔一定的时间，前一个穴位刺激后，待神经元电活动恢复基础放电后，再进行下一个穴位的刺激。

记录的神经元电活动经微电极输入 DAM50(美国WPI公司)微电极放大器后引入POWERLab(澳大利亚ADInstruments生产)生物机能信号采集分析处理系统，将模拟信号转换为数字信号传输给计算机，并对数字进行分析。

1.3 血清皮质酮浓度检测

在明确特异性相关穴位基础上，选用正常成年SD雄性大鼠30只，分别设电针特异性穴位组(电针刺激条件:5/20Hz疏密波，1.5～2.0mA，60min，以刺激局部肌肉出现抽搐反应为度)、非特异性穴位组与对照组，每组10只动物。在动物清醒状态下，分别施以电针刺激，对照组接受相同处理，只是不针刺，而静脉血是在针刺结束后即刻断头取血。采用酶联免疫吸附法(Elisa)检测血浆皮质酮浓度，以探讨特异性激活下丘脑室旁核热刺激氢化可的松敏感神经元的穴位是否也是特异性促进皮质酮分泌的穴位。实验所用的Elisa试剂盒为CUSABIO ELISA试剂盒(CSB-E070 14r)。

根据《备忘录》，联合惩戒对象为在科研领域存在严重失信行为，列入科研诚信严重失信行为记录名单的相关责任主体。联合惩戒措施将依据相关责任主体失信行为严重程度，对其采取其中一项或多项惩戒措施。43项措施中包括限制或取消一定期限申报或承担国家科技计划（专项、基金等）的资格；依法撤销国家科学技术奖奖励，追回奖金、证书；暂停或取消国家科学技术奖提名人资格；一定期限内或终身取消国家科学技术奖被提名资格等。

1.4 针刺穴位

膀胱经:肾俞、肝俞、承山;胆经:京门、阳陵泉;胃经:天枢、足三里;肾经:商曲、腹通谷、筑宾;肝经:期门、章门、太冲;脾经:腹哀、三阴交;督脉:大椎、水沟;任脉:膻中;心包经:内关;心经:神门。

1.5 统计分析

所有数据均用One-Way-ANOVA进行统计分析，以均数±标准差(珋x±s)表示。

2 结果

2.1 下丘脑室旁核神经元的定性分析

本项研究在下丘脑室旁核共记录到342个神经元单位电活动，其中有163个神经元单位对48℃热水刺激有反应(占记录总数的47.66%)，179个神经元单位对48℃热水刺激无反应(A.占记录总数的52.34%);在这47.66%的神经元单位中对热刺激有抑制性反应的42个(B.12.28%)，有增强性反应的121个(35.38%)。

在35.38%的神经元单位中，71个对氢化可的松无反应(C.20.76%)，7个呈增强反应(D.2.05%);而值得关注的是有43个对氢化可的松明显抑制、注射睾酮轻微抑制、雌激素无反应(E.12.57%)(图1)的神经元单位。这43个神经元单位为本研究要观察的下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元。

在20.76%对氢化可的松无反应神经元单位中，25个对注射睾酮后呈明显的抑制反应(F.7.31%)，9个对注射 β-雌二醇呈一定的抑制反应(G.2.63%)，2 个有增强反应(H.0.61%)。

2.2 针刺激活下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元有穴位特异性

实验观察针刺不同部位的20个穴位对下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元的激活效应(图2A为代表性的神经元电活动图，2B为分别针刺20个穴位该神经元电活动的统计分析图)。

本项研究结果观察到，这20个穴位在不同程度上均能激活下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元，这与以往的报道有相似之处［5～9，10］。但通过本项研究也有新的发现，就是这些穴位激活下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元的效应是不同的，神经元电活动由大到小的顺序为:肾俞、期门＞肝俞＞京门＞章门＞大椎＞阳陵泉、腹哀、水沟＞太冲、内关＞天枢、足三里、三阴交、膻中＞神门＞商曲、筑宾、腹通谷、承山。

图1 下丘脑室旁核 神元的定性分析

图2 A 代表性的不同穴位针刺下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元电活动。前10S为电针刺激前，30S电针刺激(2mA)，后20S为电针刺激后

图2 B 比较不同穴位电针刺下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元电活动注:与肾俞相比较:*P＜0.05，＊＊P＜ 0.01，＊＊＊P＜0.001;与期门比较:▉▉P ＜0.01，▉▉▉P ＜0.001;与肝俞比较:●P＜0.05，●●P＜0.01，●●●P＜0.001;与京门比较:P＜0.01，P＜0.001，Spike/s(%)=穴位针刺单位时间放电次数-基础放电次数/基础放电数×100%

与肾上腺位于相同或相邻神经节段不同经脉穴位间的比较，肾俞、期门、肝俞、京门与天枢、商曲、腹通谷、章门(肝俞、京门除外)、腹哀之间比较差异均有极显著统计学意义，章门与天枢、商曲、腹通谷之间差异有统计学意义。

位于后肢的穴位比较，足三里、三阴交、阳陵泉、筑宾、承山、太冲之间虽有不同的激活效应，但无统计学意义;而与肾俞、期门、肝俞、京门之间均差异有极显著统计学意义，与章门、大椎之间差异有统计学意义。位于前肢的穴位内关、神门与后肢的穴位有相同的统计结果。

位于同一经脉不同神经节段穴位之间的比较，肝俞、肾俞与承山，京门与阳陵泉，期门与太冲比较差异有极显著统计学意义。

2.3 针刺特异性穴位可提高外周血皮质酮(CORT)水平

实验比较了针刺肾俞与三阴交对皮质酮水平的影响(图3)。本项研究结果观察到，针刺肾俞能显著提高外周血皮质酮水平，与对照组比较差异有极显著统计学意义(P＜0.01);与针刺三阴交比较差异有极显著统计学意义(P＜0.01)，说明特异性激活下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元的穴位，也是促进外周血皮质酮水平增高的穴位。

图2 针刺不同穴位对外周血皮质酮水平的干预注:与对照组比较:＊＊＊P＜0.001;与三阴交比较:⊿⊿⊿P ＜0.001

3 讨论

本项研究中，实验者分别观察了针刺不同部位的20个穴位对下丘脑室旁核同步记录的43个热刺激及氢化可的松敏感神经元的激活效应，遴选了特异性相关穴位，并通过特异性穴位对外周血皮质酮水平的影响，验证了该穴位也是促进皮质酮分泌的特异性相关穴位。

3.1 定性分析下丘脑室旁核神经元

下丘脑作为内分泌系统的启动因素，在下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPAA)中起关键作用。下丘脑CRH的神经胞体主要分布在PVN，在受到应激刺激时，PVN的小细胞神经元分泌 CRH，有直接激活HPA轴的作用［11～13］。而一定量的糖皮质激素亦可通过HPA轴反馈性抑制CRH的分泌。也就是说，下丘脑室旁核CRH神经元是对应激刺激及糖皮质激素敏感神经元。

宋海英［14］等研究发现，在应激状态下，室旁核各亚核神经元处于分泌活动状态，尤其以小细胞亚核为显著。本项研究也观察到，在下丘脑室旁核有47.66%的神经元对热刺激有反应，而这些神经元中有对热刺激有抑制(42)、兴奋(121)反应的神经元。本项研究对121个兴奋性神经元单位进行了分别静脉注射氢化可的松、睾酮或雌激素定性分析。结果观察到，有36个神经元单位静脉注射睾酮或雌激素出现明显抑制或兴奋，说明这些神经元为性激素分泌相关神经元单位;只有43个神经元是热刺激兴奋、氢化可的松抑制的神经元单位，且对睾酮轻微抑制、雌激素无反应。根据下丘脑CRH神经元的生理特性，我们认为该神经元单位电活动与CRH神经元电活动有相关性，为本项研究的靶神经元单位;至于7个注射氢化可的松兴奋的神经元单位可能是CRH抑制性神经元单位电活动，而179个对热刺激无反应性神经元是与应激刺激无关的其他神经元单位。

3.2 针刺激活下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元有穴位特异性

针刺效应是一个有传入性影响功能的效应，本项目用电生理学的方法“在体”同步记录了不同穴位刺激，下丘脑室旁核热刺激及氢化可的松敏感神经元电活动，进行了与肾上腺位于相同或相邻神经节段不同经脉穴位间、与肾上腺位于不同神经节段躯干及头面部穴位间、位于后肢的穴位之间及位于前肢的穴位之间对该神经元的激活效应及强度的比较。结果表明，与肾上腺位于相同或相邻神经节段不同经脉的穴位之间比较有统计学意义，以膀胱经及肝胆经的穴位对该神经元的激活效应较明显，且与同经脉远端穴位相比差异有统计学意义。而膀胱经表里经的肾经穴位虽然也有调节效应，但相对于膀胱经穴位差异有统计学意义。或许是因为支配肾上腺分泌的肾神经的走行更接近膀胱经的走行。而肝胆经的调节效应与中医理论的肝主疏泄、胆主决断、参与精神情志活动有关;且肝胆经的走行与两胁亦较肾经接近肾神经的走行。至于远端穴位对该神经元的激活效应较局部穴位钝化。

综合以上结果，针刺调节HPA轴功能既有穴位特异性，又有经脉特异性，两者相辅相成。肾俞、期门、肝俞、京门为特异性相关穴位，膀胱经、肝、胆经为特异性相关经脉。虽然穴位在相同或相邻神经节段，但由于经脉所络属的脏腑不同，穴位各有不同的主治功能;而虽然位于同一经脉，但由于分布部位的不同，穴位的调节效应亦不同，说明针刺调节 HPA轴功能与所属经脉的主治及解剖部位均关系密切。因此在临床针刺调节HPA轴功能选穴中，既要结合穴位所在经脉，又要顾及穴位的神经节段支配。或许是针刺对内分泌的调节效应以局部取穴更明显。

3.3 特异性穴位在调节HPAA的功能方面优于非特异性穴位

已有研究表明，针刺调节HPAA的功能是通过促进下丘脑CRH的分泌，促进ACTH及CORT的分泌［15］。为验证特异性相关穴位对 HPAA的调节效应，实验设计了观察针刺特异性相关穴位与非特异性相关穴位对外周血皮质酮水平的影响。结果观察到，电刺激肾俞能明显增高外周血皮质酮水平，与对照组及三阴交穴位组比较均差异有统计学意义，说明本项研究的特异性穴位在调节HPAA的功能方面优于非特异性穴位。

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