鸡冠中透明质酸提取工艺条件的研究

徐丽萍，王派丽，王 鑫

(哈尔滨商业大学 食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

透明质酸又名玻尿酸(HA)，是以β－D－N－乙酰氨基葡萄糖和β－D－葡萄糖醛酸为结构单元、由β－1，3和β－1，4 糖苷键交替连接而成的一种直链线型聚阴离子黏多糖，呈白色、为无定形固体、无臭无味、具有强烈的吸湿性、溶于水、不溶于有机溶剂［1］.透明质酸主要分布在动物和人体结缔组织细胞外基质中，在眼玻璃体、房水、滑液、皮肤、脐带中含量较高.它在溶液中的无规则卷曲状态和它的流体动力学特点赋予透明质酸具有高度黏弹性、可塑性、渗透性、独特的流变学特性以及良好的生物相容性，是一种生物可吸收材料［2］.透明质酸像分子海绵一样，可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，是目前自然界中发现的保水性最好的天然物质，也是国际公认最好的保湿剂，有“天然保湿因子”(NMF)的美称.由于保湿性强、生物相容性好，它还是重要的医药用原料，具有很高的医用价值，使用效果特别显著.它与其他天然的或合成的聚合物相比具有更强的保水能力［3－5］.透明质酸不仅在眼科、骨科广泛应用，而且扩展到外科、妇产科、耳科、手外科、神经科等许多领域［6－7］.

1 材料与方法

1.1 实验材料

鸡冠，市售.

1.2 主要试剂与仪器

正丁醇(天津市福晨化工试剂厂);三氯甲烷(北京化工实剂厂);无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司);无水乙酸钠(温州市化工试剂厂);标准透明质酸(上海源叶生物科技有限公司);紫外可见分光光度计TU－1900 型(北京普析通用仪器有限责任公司);微型植物粉碎机FZ102 机型(天津市泰斯特仪器有限公司);旋转蒸发器R－205 型(上海申胜生物技术有限公司);电子分析天平ALC－1100.2 型(北京赛多利斯仪器系统有限公司);电子恒温水浴箱DK－98－1 型(天津市泰斯特仪器有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 浸泡

称取5 份新鲜公鸡冠，每份20 g，用乙醇溶液浸泡24 h 至鸡冠变硬为止，置于瓷盘中于干燥箱，干燥后粉碎.将粉状物倒入烧杯中，加入6～7 倍蒸馏水，搅拌均匀，静置浸泡过夜，使鸡冠粉充分溶胀，收集滤液，滤渣再按同样方法浸泡2 次，合并滤液.

1.3.2 除蛋白、脂肪

将滤液不断搅拌加入10%的固体氯化钠，完全溶解后，加入等体积的氯仿、正丁醇溶液(氯仿∶正丁醇为4∶1)，搅拌3 h 左右，采用分液漏斗分静置分层取上层水相待用.平行3 次试验，以HA 得率为指标选择最佳预处理溶液.

1.3.3 乙醇提取透明质酸单因素的选择

以透明质酸提取率为指标，根据实验条件和相关文献确定影响提取效果的因素，如乙醇体积分数、料液比、提取时间.为了确定实验中各因素对透明质酸得率的影响，进行单因素实验.即改变某一条件，固定其他条件，测定透明质酸的得率.

1)料液比单因素试验

量取5 份滤液，每份20 mL，以乙醇作为提取溶剂，分别按料液比为1∶1、1∶2 、1∶3、1∶4、1∶5 将二者混合，在乙醇体积分数为90%的条件下提取24 h 后，迅速置于水浴锅中烘干.回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即为HA 粗品.以透明质酸得率为指标，考察料液比对其影响.

2)提取时间单因素实验

量取5 份滤液，每份20 mL，以乙醇作为提取溶剂，按料液比1 ∶2 将二者混合，分别在时间为22、24、26、28、30 h，在乙醇体积分数为90%的条件下提取后，迅速置于水浴锅中烘干.回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即为HA 粗品.以HA 的得率为指标，考察提取温度对其影响.

3)乙醇体积分数单因素试验

量取5 份滤液，每份20 mL，以乙醇作为提取溶剂，按料液比1∶2 将二者混合，提取液值分别为75%、80%、85%、90%、95% 的条件下提取24 h后，迅速置于水浴锅中烘干.回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即为HA 粗品.以HA 得率为指标，考察提取液pH值对其影响.

1.3.4 乙醇提取透明质酸最佳条件的选择

根据单因素实验的结果，选择影响提取效果的三个主要因素:料液比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)，采用正交设计表L9(33)安排实验.因素水平表见表1.

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 定性定量分析实验

1.3.5.1 透明质酸得率的测定

其中:W为HA 得率(%);m为HA 粗提物质量(g);M为预处理后原料质量(g).

1.3.5.2 验证试验

量取20 mL 滤液，以乙醇作为提取溶剂，使用最佳工艺条件，做3 次平行实验.

1.3.5.3 透明质酸定性分析试验

采用紫外光谱法对HA 进行定性分析，将HA标准品与提取样品在OD 190～700 nm 范围内扫描，确定最大吸收波长，比较透明质酸标准品与样品图谱的出峰位置及峰形.

2 结果与讨论

2.1 乙醇沉淀法提取透明质酸单因素的结果与分析

选择乙醇为预处理溶剂，选取影响透明质酸的主要因素:料液比、沉淀、乙醇体积分数，对三个因素分别进行单因素实验，以透明质酸为指标，确定三个因素下的透明质酸的得率.

2.1.1 料液比单因素实验结果与分析

实验结果显示，见图1.随着料液比为1∶1 到1∶2 时透明质酸的得率显著增加，当料液比为1∶2时，得率达到最高点，继续增加料液比透明质酸得率呈下降趋势.因此，选定1∶2 的料液比为最佳比例.液料质量比是提取过程中的一个重要因素，从传质速率的角度讲，主要表现影响固相和液相主体之间的体积分数差，即传质推动力.液料质量比小，提取过程中液相体积分数增加快，两项间的体积分数差减少加快，从而使传质推动力衰减加快.其次，液料质量比的大小会影响两相的混合情况，尤其在搅拌不充分的情况下，将改变传质系数，而影响传质速率.液料质量比的提高必然会在较大程度上提高传质推动力，但也提高了生产成本及后处理难度.

图1 液料比对HA 提取率的影响

2.1.2 提取时间单因素实验结果与分析

由图2 可知，随着提取时间的延长透明质酸的得率显著增加，在提取时间为24 h 时透明质酸得率达到最高点，继续延长时间，透明质酸得率呈下降趋势.因此，为获得较好的得率并考虑节约能源，确定提取时间为24 h.由此可以看出，提取时间对透明质酸的得率有一定的影响.但需要指出的是提取时间过长也可能使透明质酸成分生物活性受到破坏，有效成分不再被溶解，同时杂质溶出量也随之增多，因此提取时间要适宜.

图2 提取时间对HA 提取率的影响

2.1.3 乙醇体积分数单因素实验结果与分析

实验结果显示，见图3.随着乙醇体积分数的升高透明质酸得率显著增加，当体积分数为90%时，透明质酸得率达到最高点，继续升高体积分数透明质酸得率呈下降趋势.因此，选定90 %的乙醇为最佳体积分数.可以看出，乙醇体积分数是提取过程中的一个重要因素.利用乙醇的溶解性，将乙醇作为溶剂对物质进行分离提纯，主要与其低碳直链醇的性质有关，分子中的羟基可以形成氢键，因此乙醇黏度很大，也不及相近相对分子质量的有机化合物极性大.

图3 乙醇体积分数对HA 提取率的影响

2.2 乙醇提取透明质酸最佳条件结果与分析

通过正交实验确定最佳的提取方法，考察指标为透明质酸得率(%)，其实验结果见表2.正交试验结果得:A2B2C2为较优条件组合.即采用提取时间为26 h，料液比1∶2，乙醇体积分数为90%，为最优条件.在上述最优条件下，HA 提取率均为3.91% .

表2 正交试验结果表

由表2 的极差分析可知，各因素对HA 得率影响的大小顺序为A ＞C ＞B，即HA 提取液与乙醇体积比＞提取时间＞乙醇体积分数.料液比对HA 得率影响达到显著，是提取HA 的主要影响因素.

2.3 直观分析

为了探索更好的实验条件的取值方向，以各因素的水平为横坐标，均值K为纵坐标绘制因素与水平直观图，结果见图4.

图4 直观分析图

通过比较正交试验表中各因素的极差值(R)，由图4 可以看出，各因素对HA 提取率影响的大小顺序为A ＞C ＞B，即料液比＞提取时间＞乙醇体积分数.料液比为1∶2、提取时间为26 h、乙醇体积分数为90%.

2.4 方差分析

对正交试验做方差分析，分析出对实验影响显著的因素有哪几项，其结果见表3.由表3 可知，其中的料液比影响效果显著.

表3 正交试验结果方差分析

由表3 的极差分析可知，各因素对HA 提取率影响的大小顺序为A ＞C ＞B，即HA 提取液与乙醇体积比＞提取时间＞乙醇体积分数.料液比对HA得率影响达到显著，是提取HA 的主要影响因素.最佳因素组合为A2B2C2，料液比为1∶2、提取时间为26 h、乙醇体积分数为90%.

2.5 验证试验结果与分析

用正交实验得出的最佳工艺参数A2B2C2做验证实验，用同批次样品在同等条件下做平行样三组，HA 得率为指标，结果如表4.

表4 验证试验

从表4 可以看出，经3 次测定，HA 提取率平均值为4.67%.

但是，设计实验中组别4 的得率为4.84%，大于正交试验优化的得率4.67%，因此需显著性分析.经t 检验显著性分析，组别4和正交试验法优化的得率之间不显著(P ＞0.05)，从经济条件考虑，选择组别4，即乙醇体积分数为85%，料液比1∶2，提取时间为26 h为最优条件.提取率为4.84%.

2.6 透明质酸定性试验结果分析

经紫外光谱扫描可知，标准品透明质酸在吸收波长198 nm 处有较稳定的吸收峰.以此确定标准透明质酸的最大吸收波长为198 nm，样品与标品的出峰位置及峰形一致.可以确定本实验提取物质为透明质酸，如图5.

3 结语

采用鸡冠为原料，以透明质酸得率为指标，对乙醇浸提法提取鸡冠中透明质酸的方法进行研究.采用正交试验确定最佳提取工艺并通过紫外光谱法对其进行检测，以乙醇为主要提取溶剂，选择乙醇体积分数、料液比、提取时间为影响因素提取透明质酸，以透明质酸得率为指标，得出透明质酸最佳提取条件为:乙醇体积分数85%、料液比1∶2、提取时间26 h，提取率为4.84%.由方差分析证明，料液比对透明质酸的得率影响效果显著.通过紫外光谱法检测，结果表明提取出物质与透明质酸标准品峰形位置一致，进一步证明从鸡冠提出的物质是透明质酸.

图5 HA 标准品与样品紫外光谱扫描曲线

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