分化和DNA结合抑制因子1基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞株MMP9表达的影响

许子志 王川 许东兴 蔡秀莺

·论著·

分化和DNA结合抑制因子1基因对MDA-MB-231乳腺癌细胞株MMP9表达的影响

许子志 王川 许东兴 蔡秀莺

目的筛选成功转染Id1 miRNA真核表达载体乳腺癌MDA-MB-231细胞系，观察对乳腺癌细胞的对Id1、MMP9表达的影响。方法构建Id1 miRNA真核表达载体，转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株以杀稻瘟霉素筛选稳定表达的细胞株。经RT-PCR方法鉴定其对Id1、MMP9表达的影响。结果经过筛选，获得转染Id1 miRNA真核表达载体稳定表达的MDA-MB-231细胞系。经RT-PCR方法鉴定，结果表明转染Id1 miRNA真核表达载体的乳腺癌MDA-MB-231细胞株其Id1、MMP9表达水平低于对照组，且Id1、MMP9表达水平正相关。未转染组与阴性对照转染组无明显差异。结论本实验成功筛选出稳定表达Id1 miRNA的乳腺癌细胞株，证实Id1 miRNA真核表达载体构建成功干扰有效，并且Id1与mmp9表达相关，为将来进一步研究他们之间的生物学行为差异，或详细了解其分子作用机制奠定了基础。

Id1；MMP9；真核表达载体；乳腺癌细胞株

Id1(Inhibition of DNA binding/differentiation)蛋白是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。被认为是分化和DNA结合的抑制剂。研究发现Id家族的蛋白在许多肿瘤中的表达是上调的[1-4]，研究证实其参与肿瘤的发生，与肿瘤细胞的恶性转化、生长、浸润、转移相关[4]。本实验室曾报道Id1与细胞增殖及血管内皮生长因子表达的关系[5]。本研究旨在探讨Id1基因与MMP9表达的关系，初步探讨Id1影响乳腺癌恶性生物学行为的机制。

1 资料与方法

乳腺癌细胞MDA-MB-232细胞株。大观霉素。Sc734-Id1单抗(兔源)，MMP9单抗(兔源)。lipofectamine2000脂质体转染试剂盒。杀稻瘟霉素。RT试剂盒A3500。Id1 miRNA干扰序列及阴性对照序列，质粒等[6]。

1.1乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的培养与传代确定杀稻瘟霉素筛选浓度为：6ng/L。

1.2以Lipofectamine2000及各重组质粒分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株及以6ng/L杀稻瘟霉素稳定转染细胞株的筛选[6]。

1.3RT-PCR法检测Id1 MMP9 mRNA表达。

1.4免疫细胞化学方法检测Id1蛋白、MMP9蛋白表达：以MMP9(1 ∶ 100)和Id1(1 ∶ 300)单克隆抗体检测、对比转染前后MDA-MB-231细胞株中MMP9及Id1蛋白表达。

2 结果

2.1在重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体的细胞克隆中，重组的目的基因包含Id1 miRNA序列。结果证实两组转染载体的细胞克隆中Id1表达与其他组不相同。稳定表达重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体B，C的两组细胞克隆中Id1RNA的表达水平降低；整合negative control阴性对照载体的细胞克隆D组中Id1RNA的表达水平与无转染A组相似(见图1)。

2.2实验结果证实转染重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体的细胞C组克隆中MMP9表达水平降低；整合negative control阴性对照载体的细胞克隆B组中Id1RNA的表达水平与无转染A组相似。

2.3转染前后Id1 1 ∶ 300稀释度下在胞浆可见程度不同阳性表达，PBS阴性对照仅见核被苏木素染色。在重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体的细胞克隆中，重组的目的基因包含Id1 miRNA序列。结果证实转染载体的细胞克隆中Id1表达明显减弱(见图3、4、5、6)。

2.4转染前后MMP9 1 ∶ 100稀释度下在胞浆可见程度不同阳性表达，在重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体的细胞克隆中，重组的目的基因包含Id1 miRNA序列。结果证实转染载体的细胞克隆中MMP9表达明显减弱。(见图5、6)

图1 各实验组Id1 PCR图

A.无转染组B.转染No.2真核表达质粒组C.转染No.3真核表达质粒组D. 转染negative control阴性对照组 M:Marker

图2各实验组MMP9 PCR图

A.无转染组B. 转染negative control阴性对照质粒组C.转染真核表达质粒组M:Marker

图3MDA-MB-231乳腺癌细胞1 d 1免疫化学表达(1 ∶ 300)×400

图4转染(C组)后MDA-MB-231乳腺癌细胞1 d 1免疫化学表达(1 ∶ 300)×400

图5MDA-MB-231乳腺癌细胞MMP9免疫化学表达(1 ∶ 100)×400

图6转染(C组)后MDA-MB-231乳腺癌细胞MMP9免疫化学表达(1 ∶ 100)×400

3 讨论

乳腺癌的浸润，转移是导致许多女性死亡的重要原因。Id1过度表达与乳腺癌发生、发展、浸润、转移关系密切。Id1蛋白可以通过多条途径影响CyclinD1的表达，推动细胞周期由G1期进入S期，通过MAPK途径促使下游早期生长反应基因转录和翻译的增加，促进细胞增殖[7]。致细胞侵袭性和迁移性增加，使其通过基底膜的侵袭力大大提高，Id1可能通过影响乳腺组织基质金属蛋白酶(MMP)，促进乳腺癌细胞的侵袭、转移等。[8]

MMP9是基质金属蛋白酶家族一员。参与肿瘤转移等病理过程。通过对肿瘤浸润和转移的机制研究发现细胞外基质(ECM)在肿瘤的的浸润和转移过程中起着关键的作用[9]。肿瘤细胞侵袭、转移能力与其诱导产生降解ECM、基底膜的蛋白酶的能力密切相关，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶能够降解ECM，从而促进肿瘤的浸润和转移[10]。

本研究通过构建miRNA真核表达载体，转染MDA-MB-231乳腺癌细胞株，成功抑制Id1基因表达。研究同时发现其也可以抑制MMP9的高表达，提示Id1与MMP9之间存在一定的内在联系，MMP9可能是Id1作用通路中的下游因子，其功能的实现可能受到Id1的调节。Id1可能通过影响MMP9表达促进肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶降解细胞外基质，促进肿瘤的浸润和转移。另肿瘤的发生，发展及侵袭过程必然伴随着新生血管的生成， VEGF被认为是最主要，最特异性的一种内皮细胞生长因子。本实验室既往研究证实Id1与乳腺癌增殖及血管生成的行为有关[5]。综合提示Id1可能通过调节MMP9、VEGF等下游因子推动细胞周期参与肿瘤的发生，发展，侵袭，转移过程。

综上所述，Id1基因与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为存在密切的关系，这可能是导致乳腺癌预后不良的生物学基础，其详细的机制值得进一步深入探究。我们设想通过抑制Id1的表达可以相应的降低肿瘤的恶性程度，抑制肿瘤细胞的浸润和转移，可能为乳腺癌的治疗开辟了一个新途径。

[1] Prognostic relevance of Id-1 expression in patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Luo KJ, et al. Ann Thorac Surg, 2012,93(5):1682-8. PMID 22480390.

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[3] Vandeputte DA， Troost D， Leenstra S， et al. Expression and distribution of Id helix-loop-helix proteins in human astrocytic tumors. Glia，2002，38(4)：329-338.

[4] Yokota Y， Moil S. Role of Id family proteins in growth contro. J Cell Physiol，2002，190(11)：21-28.

[5] 王川，洪天姿，张捷，郭雯珲，傅芳萌，卢辉山.分化和DNA结合抑制因子1基因对乳腺癌细胞株MCF-7增殖活性及分泌血管内皮生长因子的影响.中华实验外科杂志，2012，29(5)：841-843.

[6] 许子志，王川.Id1 miRNA表达载体构建与转染乳腺癌细胞.中国实用医药，2009,4(10)：8-10.

[7] Cyclin D1, Id1 and EMT in breast cancer. Tobin NP, et al. BMC Cancer, 2011 Sep 28;11:417.PMID 21955753.

[8] Caldon CE, Swarbrick A, Lee CS, Sutherland RL, Musgrove EA. The helix-loop-helix protein Id1 requires cyclin D1 to promote the proliferation of mammary epithelial cell acini. Cancer Res, 2008, 15,68(8):3026-36.

[9] MMP-2 and MMP-9 in normal mucosa are independently associated with outcome of colorectal cancer patients. Langers AM, et al. Br J Cancer, 2012,24,106(9):1495-8.PMID 22472880.

[10] Olson M W, Bernardo M M, Pietila M, et al. Characterization of the monomeric and dimeric forms of latent and active matrixet alloproteinase-9. JBiol Chem,2000,275:2661-2668.

RelationshipbetweenId1geneexpressionandMMP9inMDA-MB-231breastcancercellline

XUZi-zhi,WANGChuan,FUFang-meng,etal.

TheUnionHospitalAffiliatedofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China

ObjectiveTo select the the stabilized expressed cells lines of miRNA eukaryotic expression vector of Id1. To explore the relationship between Id1 and MMP9 expression in breast cancer line MDA-MB-231.MethodsUse Blasticidin to select stabilized expressed cell lines of miRNA eukaryotic expression vector of Id1.the level of Id1 and MMP9 was detected using RT-PCR methods.ResultsThe stabilized expressed cell lines through 2W Blasticidin selection. As a result of RT-PCR identification, the level of Id1 and MMP9 in Id1 miRNA transfeced cell line is lower than that in the control groups. While there is no difference between the not transfected and negative control transfected cell line.

Id1;MMP9;Eukaryotic expression vector;Breast cancer

351100 福建省莆田市第一医院乳腺甲状腺外科(许子志 许东兴);福建医科大学附属协和医院乳腺外科(王川);福建省莆田市涵江医院妇产科(蔡秀莺)

许子志 E-mail：xuzizhi20022002@yahoo.com.cn