高效液相色谱法测定甲硝唑片中甲硝唑含量的不确定度评定

北京市门头沟区药品检验所（102300）徐黎颖

甲硝唑片为《中国药典》2010年版二部收载的品种[1]，适用于各种厌氧菌引起的感染及炎症，亦可作为结肠、直肠等择期手术前的预防用药，还可用于治疗肠道及肠外阿米巴病（阿米巴肝脓肿等）、阴道滴虫病、小袋虫病、麦地那龙线虫病、贾第虫病等[2]。甲硝唑片的含量测定方法为高效液相色谱法（HPLC）。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。本文根据《测量不确定度评定与表示》、《化学分析测量不确定度评定》、《化学分析中不确定度的评估指南》等有关规定，分析HPLC法测定甲硝唑片中甲硝唑含量的影响因素，对其不确定度进行评定，以期为HPLC法测定化学药含量的不确定度评定提供参考。

1 测定方法与数据记录

1.1 仪器与试剂 Agilent 1200S高效液相色谱仪（Agilent公司），AE-100电子天平（METTLER公司），XP-205DR电子天平（METTLER公司），甲硝唑对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100191-200305），甲硝唑片（批号：121051）。

附表1 对照品溶液实验数据

附表2 供试品溶液实验数据

附图 不确定度的来源分析图

1.2 液相色谱条件和系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（20∶80）为流动相；检测波长为320nm。理论塔板数按甲硝唑峰计算不低于2000。

1.3 对照品溶液的制备 精密称定甲硝唑对照品约12.5mg，置50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备 取甲硝唑片20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于甲硝唑0.25g），置50mL量瓶中，加50%甲醇适量，振摇使甲硝唑溶解，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.5 色谱分析方法与数据的记录 分别精密吸取甲硝唑对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入高效液相色谱仪，按外标法以色谱峰面积计算，即为供试品中甲硝唑（C6H9N3O3）的含量。

1.6 数据记录 20片片重5.7620g，平均片重0.2881g，数据见附表1和附表2。

2 不确定度评定

2.2 不确定度的来源分析 分析实验过程中不确定度来源见附图。

2.3 不确定度的量化分析

2.3.1 供试品溶液浓度引入的不确定度urel(Cs)

2.3.1.1 对照品溶液浓度引入的相对标准不确定度urel(Cr)

2.3.1.1.1 对照品的纯度引入的相对标准不确定度urel(Pr)对照品由中国药品生物制品检定所提供，未提供不确定度值，本实验参考基准物质的不确定度值，假定对照品含量为100.00%±0.05%，视为矩形分布则对照品纯度引入的相对标准不确定度

2.3.1.1.2 对照品称样量引入的相对标准不确定度urel(Wr)称量使用电子天平XP-205DR，实际分度值d＝0.01mg，检定证书给出载荷点误差为0.03mg，重复性误差为0.02mg，则单次称量的标准不确定度：

采用减重法称量，上述分量应计算2次，故对照品称样量引入的相对标准不确定度：

2.3.1.1.3 对照品的稀释引入的相对标准不确定度urel(Vr)玻璃量具允差：对照品溶液稀释过程中用到容量瓶（50±0.05）mL（A级），按矩形分布处理标准不确定度：

环境温度：实验环境温度在空调条件下，设置室温为（20±5）℃。水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1，按照矩形分布处理标准不确定度：

2.3.1.1.4 对照品溶液浓度引入的合成相对标准不确定度urel(Cr)

2.3.1.2 对照品溶液峰面积引入的相对标准不确定度urel( Ar)实验中取对照品溶液r1、r2，分别进样5次、2次，取峰面积平均值计算。

对照品溶液r1引入的相对标准不确定度：=0.000105；对照品溶液r2引入相对标准不确定度，采用极差法计算，n＝2，C=1.13：=0.000120；对照品溶液峰面积引入的相对标准不确定度 ：=0.000159。

2.3.1.3 供试品溶液峰面积引入的相对标准不确定度urel(As)实验中供试品溶液t1、t2，分别进样2次、2次，取峰面积平均值计算。采用极差法分别计算相对标准不确定度，

2.3.1.4 供试品溶液浓度引入的合成相对标准不确定度urel(Cs)

采用减重法称量，上述分量应计算2次，故供试品称样引入的相对标准不确定度：

2.3.3 供试品的稀释引入的不确定度urel(Vs)

供试品的稀释过程中分别用到容量瓶（50±0.05）mL（A级）、（100±0.10）mL（A级）、单标线吸管（5±0.015）mL（A级），参照对照品的稀释引入的相对标准不确定度计算方法。

2.3.3.1 容量瓶（50±0.05）mL（A级）引入的相对标准不确定度

2.3.3.2 容量瓶（100±0.10）mL（A级）引入的相对标准不确定度

2.3.3.3 单标线吸管（5±0.015）mL（A级）引入的相对标准不确定度

2.3.4 平均片重引入的不确定度urel(W)

称量使用电子天平AE-100，检定分度值d＝0.1mg，检定证书中给出载荷点误差为-0.1mg，重复性误差为0.1mg，则单次称量的标准不确定度：采用减重法称量，上述分量应计算2次，故平均片重引入的相对标准不确定度

2.4 合成标准不确定度

供试品溶液浓度、供试品称样量、供试品的稀释、平均片重等影响因素相互独立，则合成相对标准不确定度urel(X)：实验测得X＝95.6%，则标准不确定度u(X)：u(X)=urel( X)×X=0.00638×95.6%=0.61%。

2.5 扩展不确定度

取包含因子k＝2，则含量测定结果的扩展不确定度U（X）：U(X)= k ×u(X)=2×0.61%=1.22%。

3 结果报告

高相液相色谱法测定甲硝唑片中甲硝唑的含量为：X＝（95.6±1.2）% ；k＝2。