高效液相色谱法同时测定强力定眩片中的天麻素、绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量

北京市石景山区药品检验所（100043）曾秋华

强力定眩片由天麻、杜仲、野菊花、杜仲叶、川芎制成，具有降压、降脂、定眩的功能，其法定质量标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》。原标准中检验项目仅有定性鉴别和常规检查，缺乏反映药品质量的量化指标，本文采用高效液相色谱法同时测定了强力定眩片中天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量。该方法准确、简便、快速，可更好地控制强力定眩片的质量。

1 材料

1.1 药物及试剂 天麻素对照品（批号：110807-200205），绿原酸对照品（批号：110753-200413），松脂醇二葡萄糖苷对照品（批号：111537-200501）均购于中国药品生物制品检定所；强力定眩片（陕西汉王药业有限公司）；自制空白样品药材购自北京同仁堂药店；乙醇（分析纯），乙腈（色谱纯），磷酸（色谱纯）；超纯水为自制。

1.2 仪器 岛津LCsolution-2010HTA型高效液相色谱仪：包括四元泵，紫外检测器，柱温箱，自动进样系统，CLASS-VP工作站。TU-1901双光束紫外可见分光光度计，BSA224S-CW及BP211D赛多利斯分析天平，KQ-250DB型数控超声波清洗器，Milli-Q超纯水机。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ODSC18柱（250mm×4.6mm，5µm）；流动相为A：0.05%磷酸，B：乙腈，梯度洗脱如下：0～6.0min，3%B；6～32min，3%～15%B；32～35min，15%～20%B；35～38min，20%～3%B；38～41min，3%B；检测波长：天麻素、松脂醇二葡萄糖苷227nm；绿原酸327nm；流速：1.0mL/min；进样量：10µL；柱温：28℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥12h的松脂醇二葡萄糖苷天麻素对照品、绿原酸对照品适量，用流动相溶解并定容制成含天麻素为104.1µg/mL、含绿原酸110.8µg/mL、含松脂醇二葡萄糖苷28µg/mL的对照品储备溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加稀乙醇25mL，称定重量，45℃超声提取30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣加流动相溶解，转移至10mL量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照品溶液制备 按照处方及生产工艺[1]，自制不含天麻、野菊花、杜仲、杜仲叶的空白制剂各一份，再按供试品溶液制备方法制备即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 阴性干扰试验 在上述色谱条件下，精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10µL进样。色谱图见附图1～6，结果显示天麻素峰、绿原酸峰、松脂醇二葡萄糖苷峰均与其他峰分离良好，阴性对照无干扰。

2.3.2 线性关系考察 精密称取天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品储备液1，3，5，10，15，20mL，分别置于20mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密量取系列对照品溶液续滤液10µL进样，记录峰面积，以峰面积为横坐标、对照品进样量µg为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，见附表1。

附表1结果提示，天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品在附表中的进样量范围内，进样量与色谱峰面积积分值线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 精密量取供试品溶液10µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，测定峰面积。结果显示，天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面积积分值的相对标准偏差分别为0.35%、0.30%、0.70%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，20h注入液相色谱仪，测定峰面积。结果显示，天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的峰面积积分值的相对标准偏差（n＝6）分别为1.17%、1.67%、1.90%，表明供试品溶液在20h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批样品，按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，在相同色谱条件下试验。结果显示，天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量的相对标准偏差分别为1.03%、1.87%、1.04%，表明方法重现性良好。

附表1 3种成分的回归方程(n＝6)

附表2 加样回收率测定结果

附表3 3批样品的三种成分含量测定结果(单位：mg/片)

2.3.6 加样回收试验 取同一个批次的样品（批号：100103039），适量，研细，取细粉约0.25g6份，分别精密加入天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，按供试品溶液的制备项下制备，测定，求得天麻素、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷平均加样回收率分别为97.81%、97.87%、95.03%，RSD分别为1.07%、2.02%、2.05%，结果见附表2。

2.3.7 样品测定 分别取不同批号的强力定眩片3批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果见附表3。

3 讨论

3.1 检测波长的确定 参考《中国药典》（2010年一版）[2]，取对照品溶液，用紫外分光光度计在200～400nm波长范围内扫描，天麻素在220nm和270nm波长，绿原酸在220nm、246nm、327nm，松脂醇二葡萄糖苷在227nm和277nm有较强吸收，对各波长进行比较发现，在227nm处三组分都具有较好的灵敏度，但绿原酸在327nm波长检测时，吸收最强，峰型好，因此选择227nm为天麻素、松脂醇二葡萄糖苷的检测波长，327nm为绿原酸的检测波长。

3.2 液相色谱条件考察 在参考有关文献[3][4][5][6]的基础上，对乙腈-0.05%磷酸（3∶97）、甲醇-水、甲醇-磷酸盐溶液（0.1%磷酸二氢钾与0.1%磷酸氢二钠等量混合）-水等不同体系流动相进行了比较，结果以乙腈-0.05%磷酸系统最佳，考察了多种不同的梯度洗脱条件，最后确定本实验的色谱条件。

3.3 提取方法的选择 在参考有关文献的基础上[7]，比较加热回流提取1h和超声提取30min的两种方法，两者检验结果无明显差异，故选用操作简单的超声提取。

3.4 提取溶剂的选择 比较甲醇、稀乙醇作为提取溶剂，甲醇和稀乙醇对指标成分的提取效率相当，从环保角度选用稀乙醇。