参苓白术颗粒微生物限度检查法的建立及检验结果分析

北京市药品检验所（100035）王似锦 刘文杰 牛振东 江志杰 张光华 高春

参苓白术颗粒由参苓白术散发展而来，后者为经典方，出自《太平惠民和剂局方》，是在四君子汤的基础上加山药、莲子、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗而成。功能主治为补脾胃，益肺气。用于脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力[1]。2009年将参苓白术颗粒收载入《国家基本药物目录》。

中药口服制剂由于其原料是中药材和中药饮片，大部分来源是植物根、茎、叶或全草，极易受到微生物的污染，如果生产和加工控制不利，则会导致成品的微生物污染问题，最终有可能会影响药品质量，危害患者的健康[1]。因此，《中国药典》2010年版一部[2]附录制剂通则中规定，中药颗粒剂应进行微生物限度检查。本文对来自全国3个生产厂家54个批次的参苓白术颗粒进行微生物方法学验证，建立了微生物限度检查法，进行了微生物限度检查，并对检验结果进行了分析讨论。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DL-CJ-2ND型超级洁净工作台（北京东联仪器制造有限公司）；HFsafe-1500生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 样品 本试验所用样品来自3个生产厂家54个批次，详细信息见附表2。

1.3 培养基和稀释液 营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）、乳糖胆盐发酵培养基，均按照《中国药典》2010年版一部附录[2]要求配制，灭菌。稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。按照《中国药典》2010年版一部附录[2]要求配制，灭菌。

1.4 菌种及菌液制备 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） [CMCC（B）26 003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]均购自中国食品药品检定研究院。按照《中国药典》2010年版一部附录[2]要求配制菌液。

2 方法

2.1 供试液的制备 取本品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，振摇，制成1∶10的供试液。

2.2 细菌计数、霉菌和酵母菌计数验证方法

2.2.1 菌液组 分别取“1.4”中的菌液1mL，注入平皿中，加入培养基，测定菌液中的菌落数，结果为a。

2.2.2 样品对照组 取“2.1”中的1∶10的供试液1mL注入平皿中，加入培养基，测定样品中的菌落数，结果为b。

2.2.3 验证组 取“2.1”中的1∶10的供试液1mL和“1.4”中的菌液1mL分别注入同一平皿中，加入培养基，测定菌落数，结果为c。

2.2.4 稀释剂对照组 取“2.1”中的稀释剂1mL和“1.4”中的菌液1mL分别注入同一平皿中，加入培养基，测定菌落数，结果为d。

附表1 参苓白术颗粒微生物限度检查验证各菌的回收率（%）

附表2 参苓白术颗粒微生物限度检查结果

据《中国药典》2010版一部附录[2]，若R2≥70%，而且R1≥70%，可认为该稀释液制备方法和计数方法可用于该样品的菌落计数。若R2＜70%则表明该稀释液本身有抑菌作用，该稀释液不可用于菌落计数。若R2≥70%，而且R1＜70%，可认为该稀释液制备方法和计数方法不能用于该样品的菌落计数。若使用药典收载的稀释液，稀释剂对照组可不进行试验。

2.4 微生物限度检查 按照微生物方法学验证所建立的微生物限度检查法进行，并对结果进行分析讨论。

3 结果

3.1 细菌计数方法学验证结果 分别选取了3个生产厂家的各2批产品，按照2.2进行微生物方法学验证，结果见附表1，采用常规注皿法，也就是1∶10的供试液，1mL/皿的方法进行验证试验，5种验证菌株的回收率达到了70%以上，满足药典的要求。因此，细菌计数、霉菌和酵母菌计数应采用该方法进行。

3.2 霉菌和酵母菌计数、大肠埃希菌检查和大肠菌群检查方法学验证结果 取1∶10的供试液10mL，置胆盐乳糖培养基100mL中，阳性对照菌生长良好，此方法可行。

来自3个厂家的样品，其中来自北京汉典制药有限公司生产的参苓白术颗粒的生产工艺含有中药原粉，因此需要进行大肠菌群检查。其验证结果为，取含10mL的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1∶10、1∶100、1∶1000的供试液各1mL，阳性对照菌生长良好，此方法可行。

3.3 微生物限度检查结果分析 54个批次的参苓白术颗粒微生物限度检验结果见附表2。其中，霉菌和酵母菌数有1批的结果是15cfu/g，其余均为＜10cfu/g，大肠埃希菌检查均为1g中未检出，只有北京汉典的产品需要进行大肠菌群检查，其结果均为＜10个/g。

对54个批次样品的细菌数结果进行了统计，结果显示，细菌数小于100cfu/g的检品占总数的88.89%，大于100cfu/g小于1000cfu/g的占11.11%。没有超过1000cfu/g的批次。54批次的参苓白术颗粒的微生物限度检查结果统计为54个批次均符合规定，合格率为100%。

54个批次的参苓白术颗粒按照生产厂家进行分类，并分别按照细菌数x≤10，10＜x≤100，100＜x≤1000的批次数进行评价，结果见附表3。由云南腾冲生产的产品占总检品数的44%，是抽取最多的一个生产厂家。与其他两个企业相比，北京汉典生产的参苓白术颗粒细菌数小于10的只有1批，其余均大于10，这也许是由于企业所采用的工艺与其他两家企业不同，其产品中含有中药原粉，按照《中国药典》的要求，应该进行大肠菌群检查，并且细菌数的限值是10000cfu/g。

4 结论

对3个生产厂家的6批参苓白术颗粒进行微生物限度方法学验证试验表明，细菌计数、霉菌和酵母菌计数，采用1∶10的供试液1mL注皿。大肠埃希菌检查和大肠菌群检查均采用常规法即可。按照上述方法进行微生物限度检查，结果表明，来自3个厂家54个批次的参苓白术颗粒的微生物限度均符合规定，结果较为满意。

附表3 参苓白术颗粒细菌数分布表