沉默ABCC4基因表达对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖的影响

马瑾 张卓 王建承

·论著·

沉默ABCC4基因表达对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖的影响

马瑾 张卓 王建承

目的检测ABCC4基因沉默后对人胰腺癌PANC1、BxPC-3细胞增殖及细胞周期的影响。方法构建插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体，感染人胰腺癌细胞株PANC1和BxPC-3。采用实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测感染细胞的ABCC4 mRNA及蛋白表达，克隆形成实验测定感染细胞形成的克隆数，流式细胞仪检测感染细胞的细胞周期。结果成功构建了插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体。重组慢病毒感染PANC1及BxPC-3细胞后，细胞ABCC4 mRNA表达被抑制(0.28±0.01比1.00±0.03，0.22±0.02比1.00±0.03，P值均<0.05)；ABCC4蛋白表达亦显著下调；感染的PANC1细胞克隆形成数量显著减少(4比65，P<0.05)；细胞周期阻滞在G1期[(54.98±1.78)%比(42.93±0.88)%，(68.55±0.75)%比(54.76±0.29)%]。结论沉默人胰腺癌PANC1和BxPC-3细胞的ABCC4基因表达可显著抑制癌细胞的增殖，使细胞阻滞于G1期。

胰腺肿瘤； ABCC4； 细胞增殖； RNA干扰； 慢病毒感染

ABCC4(ATP-binding cassette sub-family C member 4)又称MRP4(multi-drug resistance-associ-ated protein 4)，是Cole等在研究小细胞肺癌过程中发现的耐药基因家族[1]。人类的ABCC4定位于染色体13q32，转录编码该家族中分子量最小的蛋白。文献报道[2]，ABCC4参与多种细胞对核苷酸类似物如6-巯基嘌呤及硫鸟嘌呤等抗肿瘤药物的耐药。然而，有关ABCC4基因在胰腺癌发生、发展过程中对肿瘤细胞增殖、浸润和转移所起的作用尚未见报道。本研究应用RNA干扰技术将靶向ABCC4的干扰片段通过慢病毒载体感染胰腺癌PANC1及BxPC-3细胞，观察感染后细胞的增殖及细胞周期的变化。

材料与方法

一、慢病毒载体的构建和人胰腺癌细胞的感染

针对ABCC4基因设计靶向ABCC4的shRNA(ABCC4-shRNA)和阴性对照的shRNA-C。ABCC4-shRNA序列为5′-CTAGCCCGGGCACTCATTAAA-TCACAAGAACTCGAGTTCTTGTGATTTAATGAGTGC-TTTTTTGTTAAT-3′，siRNA-C序列为5′-CTAGCC-CGGTTCTCCGAACGTGTCACGTATCTCGAGATACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTTTAAT-3′。两端分别添加了Age I和EcoR I酶切位点，由上海吉玛生物有限公司设计合成。慢病毒载体PGCSIL-GFP购自中国上海吉凯公司。通过酶切慢病毒载体与shRNA连接，构建重组慢病毒载体。重组慢病毒通过慢病毒包装质粒共同感染HEK 293T细胞，常规培养。收集和浓缩培养上清液，获得含有ABCC4-shRNA或shRNA-C的重组慢病毒。

人胰腺癌细胞系PANC1及BxPC-3购自中科院上海生命科学院细胞资源中心，常规培养、传代。按104个细胞密度接种于6孔板，培养过夜。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)将重组病毒感染胰腺癌细胞(感染复数为10)，按说明书操作，以未感染慢病毒的细胞作为对照。

二、实时定量PCR

收集各组感染后培养5 d的胰腺癌细胞，采用Trizol(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，取1 μg RNA反转录成cDNA，采用标准SYBR Green RT-PCR试剂盒(Takara公司)检测细胞ABCCR mRNA的表达，按说明书操作。PCR反应条件：95℃ 15 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，45个循环。通过PCR仪自带软件读取原始Ct值，采用2-△△Ct公式计算mRNA相对表达量。

三、蛋白质印迹法

收集各组慢病毒感染7 d的胰腺癌细胞，采用细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液，测蛋白浓度后，常规行蛋白质印迹法检测ABCC4蛋白，以GAPDH为内参。羊抗人ABCC4多抗购自美国Santa Cruz公司。ECL+plusTM Western blotting system试剂盒购自美国Pierce Chemical公司，按说明书操作。

四、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法

取各组对数生长期慢病毒感染5 d的PANC1细胞制成细胞悬液，以每孔4×103个细胞密度接种于96孔板分别培养1、2、3、4、5 d。每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，继续培养4 h，吸去培养液，加100 μl DMSO终止反应，振荡10 min，上酶标仪测各孔570 nm处的吸光度(A570)值，绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

五、克隆形成实验

取各组对数生长期慢病毒感染5 d的细胞，于6孔培养板中各加入300个细胞，每组设3个复孔。培养2周后用多聚甲醛1 ml固定细胞60 min，Giemsa液500 μl染色细胞20 min，双氧水清洗，荧光显微镜下观察克隆形成情况。

六、细胞周期检测

取各组对数生长期慢病毒感染5 d的细胞，用预冷的PBS洗涤液清洗2次，加900 μl预冷的70%乙醇4℃固定过夜，加入碘化丙锭(PI)染色，300目的筛网过滤，上流式细胞仪检测细胞周期。

七、统计学处理

结 果

一、胰腺癌细胞ABCC4基因表达量的变化

约90%的慢病毒感染5 d的PANC1或BxPC-3细胞在荧光显微镜下均表达绿色荧光蛋白(GFP)，表明慢病毒的感染率达到90%以上(图1)。感染ABCC4-shRNA重组慢病毒[RNAi(+)]的PANC1及BxPC-1细胞的ABCC4 mRNA表达量分别为0.28±0.01和0.22±0.02，而感染shRNA-C重组慢病毒[RNAi(-)]的PANC1及BxPC-1细胞的ABCC4 mRNA表达量分别为1.00±0.03和1.00±0.03，RNAi(+)细胞较RNAi(-)细胞的表达量显著下调(P值均<0.05)；RNAi(+)的PANC1和BxPC-1细胞ABCC4蛋白表达亦较RNAi(-)的相应细胞显著下调(图2)。

图1慢病毒感染的胰腺癌PANC1(a、b)和BxPC-1(c、d)细胞(a、c：白光视野，b、d：绿色荧光视野 ×100)

1:RNAi(-)；2:RNAi(+)

图2感染重组慢病毒的PANC1(a)、BxPC-3(b)细胞的ABCC4蛋白表达

二、胰腺癌细胞生长曲线的变化

RNAi(+)的PANC1、BxPC-3细胞的生长曲线均较RNAi(-)的相应细胞的生长曲线低而平(图3)。

图3感染重组慢病毒的PANC1(a)、BxPC-3(b)细胞的生长曲线

三、胰腺癌PANC1细胞克隆形成能力的变化

RNAi(+)及RNAi(-)的PANC1细胞的克隆形成数量分别为4个和65个，RNAi(+)的PANC1细胞克隆形成数显著减少(P<0.05，图4)。

四、胰腺癌细胞周期的变化

RNAi(+)的PANC1和BxPC-3细胞的G1期细胞数较RNAi(-)的相应细胞显著增加，而S期细胞数显著减少，提示ABCC4基因沉默后胰腺癌细胞的生长阻滞于G1期(图5，表1)。

图4 形成的PANC1细胞克隆

图5 感染重组慢病毒的PANC1、BxPC-3细胞的周期变化

细胞细胞数G1SG2/MPANC1RNAi(-)42.93±0.8837.66±1.4219.42±0.7RNAi(+)54.98±1.7822.24±5.2122.78±3.44BxPC-3RNAi(-)54.76±0.2939.27±1.795.97±1.25RNAi(+)68.55±0.7520.78±3.0810.67±2.39

讨 论

目前， ATP结合蛋白超家族已经拥有了13个成员。研究结果显示，ABCC4在肺癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌和前列腺癌中均有不同程度的高表达。在神经母细胞瘤中，ABCC4的高表达与肿瘤的预后呈显著的正相关。ABCC4的高表达与多种实体瘤对药物及其结合代谢产物、铂类化合物、叶酸抗代谢物、腺苷及腺苷类似物的耐药有关[3]。在胰腺癌中，ABCC4被证实可以影响癌细胞对5-FU药物的敏感性，在5-FU耐药细胞中特异性表达上调[4-5]。

本研究利用RNA干扰技术，成功构建了插入靶向ABCC4的shRNA片段的重组慢病毒载体，感染人胰腺癌细胞株PANC1和BxPC-3后可沉默ABCC4基因的表达。研究结果显示，ABCC4基因表达沉默后的PANC1和BxPC-3细胞的增殖被显著抑制，克隆形成能力极弱，推测ABCC4可能是一个促癌基因。通过对细胞周期的检测，PANC1和BxPC-3细胞的增殖被阻滞在G1期，也就是细胞DNA合成期，进一步表明下调ABCC4的表达可使人胰腺癌细胞的增殖得到明显抑制，与文献报道一致[6-7]。

但ABCC4基因的表达在肿瘤发生和发展的过程中所起的促增殖作用的具体分子机制目前还不是十分明确，这需要进一步的实验研究予以探讨和证实。

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EffectofABCC4genesilencingoncellproliferationandcellcycleinhumanpancreaticcancercelllinesPANC1andBxPC-3

MAJin,ZHANGZhou,WANGJian-cheng.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospitalLuwanBranch,ShanghaiJiao-TongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200020,China

Correspondingauthor:WANGJian-cheng,Email:jiancheng_wang@hotmail.com

ObjectiveTo determine the effect of ABCC4 gene silencing on cell proliferation and cell cycle in human pancreatic cancer cell lines PANC1 and BxPC-3.MethodsPANC1 and BxPC-3 pancreatic cancer cells were transfected with a lentivirus expressing an ABCC4 short hairpin RNA (shRNA). ABCC4 mRNA and protein expression of transfected cells was determined by RT-PCR and Western blot, colony formation ability was measured by colony assay, and cell cycle change was investigated by the flow cytometric analysis.ResultsLentivirus expressing an ABCC4 short hairpin RNA (shRNA) was successfully established. After transfection with shRNA lentivirus, ABCC4 mRNA and protein expression were significantly inhibited (0.28±0.01vs1.00±0.03, 0.22±0.02vs1.00±0.03,P<0.05). Colony formation ability was significantly decreased (4vs65,P<0.05), and cell cycle was significantly blocked at G1phase [(54.98±1.78)%vs(42.93±0.88)%, (68.55±0.75)%vs(54.76±0.29)%].ConclusionsABCC4 gene silencing can significantly inhibit cell proliferation of human pancreatic cancer cell lines PANC1 and BxPC-3, and block the cells at G1phase.

Pancreatic neoplasms; ABCC4; Cell, proliferation; RNA interference; Lentivirus infections

2012-12-12)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.011

200020 上海，上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院消化内科(马瑾)；上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科(张卓、王建承)

王建承，Email: jiancheng_wang@hotmail.com