工业制备高压液相色谱系统的推广应用研究

秦 学 赵新燕 李洪彬

0 引言

随着现代制药行业的快速发展，大规模高纯度地分离制备某种药物单一有效组分是目前研究的重点和难点，如何以最低的提取成本获得最高的提纯纯度和最大的纯品产率也是药企最关心的问题。色谱分离技术是最主要的分离纯化技术之一，制备色谱是分离科学中最有效的制备型分离技术，是很多研究领域和生产车间必不可少的分离手段，高压制备液相色谱已成为当今高效分离和纯化技术研究的重点和前沿。从20世纪初发展至今，色谱技术在理论上已从线性色谱发展到非线性色谱，在实践中则从分析规模发展到制备和工业生产规模。工业制备色谱越来越被认为是应对制药工业中纯化挑战的最有效工具。本文将详细介绍工业制备液相色谱系统的构成及应用情况，为设备下一步的推广应用提供技术指导和参考。

1 制备液相色谱与分析液相色谱的区别

1.1 制备液相色谱

制备型色谱（非线性色谱），一般进样量要比分析型色谱大的多。要求能有适当的分离度，并要考虑目标产物的纯度、产量、生产周期、运行成本等。用于分离、富集或纯化混合物中的某一或某些组分，上柱量可为克、千克级乃至更多。

1.2 分析液相色谱

分析型色谱（线性色谱），分析色谱需要全面地反映样品组成的信息，希望能在尽可能小的进样量情况下，提供尽可能高的组分分辨率和线性的分离特性，但不必收集特定组分，洗脱液通常废弃。用于对被测组分的高精度分析；样品上柱量可低至微克级。

由以上可以看出，制备型液相色谱与分析型液相色谱的差别在于后者的目的在于鉴别及鉴定，不需对样品进行回收；而前者的目的在于从一混合物中分离得到纯化合物，是一个纯化的过程。制备型液相色谱的上样量较大，通常需要特定的装置和一定的操作条件。

2 工业制备液相色谱系统构成

与分析型液相色谱一样，工业制备液相色谱系统一般也由制备色谱柱、高压输液泵及进样泵、在线检测器、馏分收集装置、工作站软件、电气控制系统以及液相辅助部分构成。图1所示为聊城万合工业制造有限公司自主研发的300型工业制备液相色谱系统外观图，图2为色谱分离操作的简单流程图。下面将重点介绍每部分结构的主要特性。

2.1 制备色谱柱

色谱柱是色谱工艺的核心。它主要涉及2个方面：柱技术（包括柱设计和装柱）和填料。

动态轴向压缩（Dynamic Axial Compression，DAC）技术是目前公认的制备色谱柱（特别是柱径大于100 mm）的最佳技术。其基本原理是选定适当的填料作为固定相，匀浆后注入制备色谱柱，操作动态柱液压控制系统，使活塞压缩并挤出匀浆液，使柱床产生设定的内部压强，并保证柱床稳定。其核心技术是通过活塞的上下运动来装柱、维持柱压和卸柱，活塞运动和压力维持靠的是液压，液压动力比弹簧动力的轴向压缩柱更稳定，更均匀。活塞周边配备的特殊设计的密封圈，既能容许活塞上下自由滑动，又能保持高的密封压。DAC技术能在大规模工艺放大中保持很好的重现性，例如内径1 600 mm的高压DAC柱已经商品化应用于实际生产中。图3所示为DAC柱的原理图。

至于填料，市场上已有许多成熟产品应用于工业制备液相色谱中，大部分为国外生产，特别是高质量、高性能填料国内生产的还很少。填料的物理、化学特性是柱系统选择的重要参数，一般根据生产工艺选择，但对于大规模制备液相色谱柱来说，推荐使用填料粒径一般在10～40μm为宜，考虑到设备压力等因素，不推荐使用小于5μm的填料。

2.2 高压制备输液泵（洗脱用）及进样泵

高压输液泵是工业制备液相分离提纯的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统中。目前使用最广、性能最稳定的是双柱塞型往复式恒流泵（图4）。与分析型输液泵不同的是，工业制备用泵流量要大得多，一般在1 L/min（60 L/h）以上，对于直径超过1 000 mm的制备系统，流量可达100 L/min（6 000 L/h），但压力没有分析泵高，一般小于20 MPa。

由于柱径增大上样量也跟着提升，一般需要单独进样泵来实现快速大量进样。进样泵的设计与洗脱用输液泵原理一致，也是柱塞式往复恒流泵。为了节约成本，可以用一台泵即实现洗脱功能，同时也可用于进样，这时只需连接一个可以切换的三路并联入口阀即可实现。

2.3 在线检测器

检测器也是工业制备液相色谱系统的三大关键部件之一。检测器是用于连续监测被色谱系统分离后的柱流出物组成和含量变化的装置。其作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的电信号，完成定性定量分析的任务。常用色谱检测器有紫外—可见光检测器（UV—Vis）、示差折光指数检测器、电导检测器和蒸发光散射检测器，其中UV紫外—可见光检测器应用最广泛，使用率在70%以上。

工业制备用色谱检测器，一般来说要实现在线监测功能，必须换用高流通量的专用流通池，以保证大流量的柱后溶液能够迅速被检测分离，保证回收的馏分纯度。

2.4 馏分收集装置

通过动态轴向压缩柱洗脱的柱后溶液，经过检测器分析检测后分流到不同的储液罐实现收集。用户可以按样品分离后组分流出的先后次序，或按时间、或按色谱峰的起止信号，根据控制软件预先设定好的程序，自动完成收集工作。其工作原理：在无组分流出时，气控阀与废液瓶连接，当某一个组分流出时，对应某个气控阀会切换至打开（收集）位置，同时废液阀关闭，收集一个组分，以此重复，直至最后一个组分收集完成后，废液阀切回原处，完成一个样品的收集工作。如图5所示。

2.5 电气控制装置

电气控制系统主要实现以下功能：变频器脉冲信号控制；多路气动阀控制信号；信号采集；通过触摸屏面板进行简单的现场操作控制。

2.6 工作站软件

主要用于数据采集、数据处理、仪表控制的色谱数据处理站。图形化的人机界面，具有可编程的逻辑监控和操作界面系统，包括监控程序、操作程序和外部设备；用户控制系统确保安全、可靠、连续。能够显示设备运行过程中的实时在线监测数据，包括压力、流量、检测波长信息等。聊城万合工业制造有限公司自主研发的工作站软件操作界面如图6所示。

3 工业制备液相色谱分离操作的一般步骤

对于没有接触过制备液相色谱设备和操作的人员来说，如何快速使用制备液相色谱设备进行分离操作是他们最关心的问题。下面将简单介绍如何进行制备液相色谱的分离生产操作。

3.1 明确制备柱分离前期目标

3.1.1 了解样品性质

包括样品的组成、基体的物理或化学性质、复杂性（合成产品还是天然产品）、各组分的性质、相态（固态还是液态，溶解度等）、浓度（目标物在样品中是大量还是微量存在）、价值（原料是否昂贵、易得，目标物价值是否昂贵）。只有掌握样品的初步情况，才能在后面建立分离方法时有的放矢，节省人力物力。

3.1.2 明确纯度要求

对于制备型分离，产品通常都有纯度要求，目标产物只要达到我们要求的生产纯度指标要求即可，如有些初步鉴定要求70%的纯度就可以，而作定量分析用的必须要达到99%以上。只有了解产品对纯度的要求，才能建立起最经济适用又最高效的分离方法。

3.1.3 综合考虑制备产量、时间和成本

确定制备量便于选择色谱柱的规格型号；时间长短也是分离过程中需要考虑的重要因素，比如目标物不能经过长时间的过程分离，必须尽快完成分离过程；多数情况下，制备型分离最后都要考虑目标收集物的制备成本，尤其是一些生物工程药物生产，纯化成本甚至占到产品成本的80%，因此必须综合衡量各因素之间的关系。

3.2 制备型分离操作一般步骤

由于制备型色谱分离特别是工业生产规模色谱分离需要的上样量特别高，所需的固定相填料和消耗的洗脱用试剂量特别大，因此直接进行制备操作成本会很高。鉴于此，一般操作方法是先通过分析液相获得基本图谱信息和工艺条件（包括试剂种类、洗脱方式、流量、压力、上样量），然后放大到50 mmDAC柱进行中试实验，摸索最佳的分离条件，然后再过渡到生产规模使用。制备型色谱分离操作的一般步骤如图7所示。

4 工业制备液相色谱系统的应用现状和前景

4.1 工业制备液相色谱分离系统的应用现状

目前，制备液相色谱已广泛应用于天然产物有效成分的分离纯化及天然植物提取、中草药活性成分的分离纯化、化学合成物质的分离纯化、蛋白质和多肽等生物大分子的分离制备及手性分离。

已有许多文献对采用制备液相色谱分离天然产物有效成分（如黄酮类化合物、苷类化合物、生物碱类化合物）中药活性成分、蛋白多肽等进行了报道。

田娜等采用制备液相色谱法从荷叶中分离制备黄酮类化合物，纯度达到99.13%。朱靖博等用动态轴向压缩工业色谱系统DAC250系统（直径250 mm×1 000 mm）分离丹参脂溶性单体化合物，分离出纯度达98.5%的丹参酮ⅡA、96.2%的丹参酮Ⅰ以及97.8%的隐丹参酮。杨明等建立了用制备型HPLC制备石杉碱甲的方法，纯度达90%以上。彭密军等采用制备高效液相色谱技术，从杜仲叶提取物中分离纯化得到高纯活性成分绿原酸，绿原酸的纯度达98.61%。秦学等利用制备型高效液相色谱制备天然发酵辅酶Q10并分离出杂质，获得目标产品纯度达92.8%。王传金等采用反相高效液相色谱技术，分离制备冬凌草中冬凌草甲素，产品纯度达99%。韩金玉等采用正相液相制备色谱柱（ID80 mm×1 000 mm）分离纯化三七叶甙精制物，得到了人参皂甙单体Rb3，纯度达95%。蔡焕新等通过从线性分析色谱直接放大到制备液相色谱，分离得到了多个纯度较高的多肽。

目前应用这些设备已成功开发出十几种中药有效部位及单体成分的分离纯化与制备工艺技术，成分包括：抗菌素类、黄酮类、生物碱类、皂苷类、内酯类等。前列腺素甲酯、替考拉宁、紫杉醇、银杏黄酮、银杏内酯、槲皮素、异鼠李素、银杏内酯等中药的有效成分都已找到了合适的制备工艺路线。目前文献研究使用的制备柱柱径范围一般在20～100 mm，超过200 mm的工业制备应用文献还比较少。

4.2 工业制备液相色谱分离系统推广需要解决的问题和应用前景

制备液相色谱作为一种新型高效的分离技术，目前的发展趋势是开发大规模工业应用途径。然而，现有的理论结构还很不完善，不能指导制备型分离过程的放大和优化。特别是涉及柱超载、柱设计等问题，还远未解决。从工业应用角度出发，今后主要应解决以下几方面问题：

对中试规模和产业化当中指导制备型分离过程优化和放大的非线性色谱理论进行研究。只有在这方面取得突破性进展之后，才能掌握制备型分离过程的最优设计。按照化学工程的观点，对制备型分离过程进行模拟、优化和放大研究，为整个过程最优设计提供科学依据。开发适用于工业制备型分离过程的低成本、通用型和高选择性填料，以降低生产成本和提高产品纯度。对制备型分离过程的关键设备—色谱柱及其内件进行最优设计，正确选择流程和工艺参数，以适合工业规模的应用。

此外，工业制备色谱是一种高投入的分离技术，至今为止，主要使用在分离与纯化高附加值且纯度要求高的产品，因而在生物技术和制药业中发展尤为迅速。遗憾的是，大规模制备液相色谱设备在我国的使用才刚刚开始，仍有待于进一步开发和研究。

随着这些问题的逐渐解决，工业制备色谱系统必将在更加广泛的领域发挥更加重要的作用，在制药工业现代化进程中具有广阔的发展与应用前景。

5 结语

工业制备色谱以其高效的分离优势在制药行业分离纯化研究中发挥着越来越重要的作用，特别是在天然产物有效成分、中药活性成分、蛋白多肽等的分离纯化工业中引起人们的广泛关注。工业制备色谱技术由于具有其他方法无可比拟的特点及强大的分离能力必将成为分离与纯化领域中的主要方法之一。我国是中草药的发源地，具有丰富的药材和其他天然资源，大规模工业化制备液相色谱的研究、开发、应用对我国中草药和稀有天然资源尤其是制药业的开发与综合利用将会发挥出更大的作用，为临床用药、中药饮片的剂型改革、中药的现代化生产及质量控制、进一步提高中药药用价值以及对我国的天然药物进入国际市场起到极大的促进作用。（兴业杯参赛论文）

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