大鼠黄褐斑动物模型的建立

蒲春霞，何海蓉

(成都大学医护学院，四川成都，610106)

黄褐斑是一种多因素、多系统、多环节所致的色素性皮肤病，发病机理复杂，真正的发病原因目前尚不十分清楚，也无疗效确切的中、西医治疗方案［1，2］。其作为一种色素增加性皮肤病，控制黑素生成是其治疗的根本。黑素细胞合成黑素是一个非常复杂的过程，受到多种因素的影响。笔者根据黄褐斑的发生与内分泌紊乱有关及目前学术界通行的“雌激素和黄体酮增多进而刺激黑色素细胞而致色素沉着”的发病学假说［3］，用黄体酮注射液(孕激素)攻击雌性大鼠，复制黄褐斑动物实验模型，以期为探索其发病机制和治疗方案提供基础。

1 材料与方法

1．1 动物和试剂

SD大鼠，普通级，20只，体重220．6～250．0 g，雌性。供应单位:成都中医药大学实验动物中心，生产许可证号:SCXK(川)2008-11，质量合格证号:NO．0006174。黄体酮注射液，规格:1 mL:20 mg，批号:091101，浙江仙琚制药股份有限公司生产，试验时无需配制。超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，批号:20100312，丙二醛(MDA)测定试剂盒，批号:20100408，南京建成生物工程研究所第一分所生产。酪氨酸标准品，规格:100 mg/支，批号:140609-200711，中国药品生物制品检定所出品。TP总蛋白测定试剂盒(双缩脲法)，规格:6*50 mL，批号:1209071，四川省迈克科技有限责任公司生产。

1．2 仪器设备

DW-40L188型低温保存箱(－40℃)，青岛海尔科技有限公司;岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪;日本TMS-1024I型全自动生化分析仪，日本东京贸易医疗系统株式会社生产。

1．3 实验方法

雌性大鼠20只，按体重随机分为正常组、模型组，每组10只动物。模型组每日于大鼠后腿根部以7．5 mg/kg(相当于人用临床剂量的3倍)肌肉注射20 g/L黄体酮注射液1次，正常组注射等体积注射用水，连续注射30 d。

1．4 观察指标和检测方法

1．4．1 血液流变性测定 末次给药后次日，大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血3 mL，肝素(80×103 u/L)抗凝，测定血液流变性各指标。

1．4．2 肝脏、皮肤组织中酪氨酸含量测定 试验大鼠取血后处死，取背部皮肤(脱毛)及肝脏各1块，用预冷生理盐水(4℃)冲洗，除净杂质，滤纸拭干，切取皮肤、肝脏各0．5 g，分别放入盛有2．0 mL预冷生理盐水的小烧杯内，剪碎后匀浆，匀浆液3 500 r/min离心15 min，取上清液在全自动生化仪上测定匀浆液总蛋白含量，用于计算每克组织中各指标含量或活性。

1．4．3 肝脏、皮肤组织中MDA含量和SOD活性测定 取上述匀浆上清液按说明书操作，采用试剂盒检测肝脏及皮肤中MDA，SOD。按说明书公式计算MDA含量及SOD活力。

1．4．4 皮肤黑色素细胞的病理形态学检查 末次造模给药24 h后，麻醉、腹主动脉取血处死大鼠，取大鼠背部去毛皮肤1块，Bouin液固定。常规石蜡包埋切片，片厚4 μm，载玻片经防脱处理后捞片、烘片。再经常规脱蜡至水，PBS水洗，以H2O2质量浓度为30 g/L的H2O2溶液封闭，用鼠抗人单克隆抗体HMB45(mdantmaa黑素瘤)为第一抗体，以ElivisionTMplus免疫组化方法显示表皮中的黑色素颗粒，苏木素染色，中性树胶封片。光学显微镜观察黑色素细胞在表皮中的分布及分泌功能情况，黑色素阳性目标用计算机进行图象分析。在奥林巴斯BX41-32P02显微镜100倍窗口下，每片观察5个不同视野，找到阳性目标(表皮和附件上皮细胞胞浆中出现棕色反应)并拍照后，用成都泰盟科技有限公司生产的BI-2000型图像分析系统对目标图象进行定量分析，计算其积分光密度、平均光密度、平均灰度、目标面积和分布密度。

1．5 数据统计处理

对皮肤及肝脏中的酪氨酸，MDA，SOD含量及皮肤黑色素细胞的积分光密度、平均光密度、平均灰度和目标面积进行正态性检验，符合正态性检验则进行方差齐性检验，然后选择t检验进行统计，不符合正态性检验则采用非参数检验进行统计。

2 结果与分析

大鼠造模后，全血粘度均有明显升高(P＜0．05)，其余指标除血浆粘度和红细胞压积外，也均有不同程度的升高，但无统计学差异(表1)。模型组大鼠组织酪氨酸含量均明显升高(P＜0．05)(表2)。模型组大鼠肝脏SOD活力明显降低(P＜0．05)，皮肤MDA含量明显升高(P＜0．05)(表3)。大鼠黑色素细胞染色深浅度用灰度值和光密度值表示，颜色越深，灰度值越小，光密度值越大。积分光密度是平均光密度与面积的乘积，颜色越深，面积越大，积分光密度越高。造模后大鼠黑色素细胞平均灰度值明显低于正常组，统计学有极显著差异(p＜0．001)，平均光密度值、积分光密度值、目标面积和分布密度均明显高于正常组，统计学有极显著差异(p＜0．001)(表4)。

表1 黄体酮致黄褐斑模型大鼠血液流变性影响(x±SD)

3 结论与讨论

黄褐斑作为弥漫性过度色素沉着，常伴内分泌失调，在垂体分泌促肾上腺皮质激素时，也分泌过量的黑色素细胞刺激素，因而皮肤黑色加深。黑色素过多的原因之一是由于皮肤黑色素产生过多，而酪氨酸酶在黑色素生物合成过程中起着极为重要的作用。酪氨酸酶是黑色素代谢中的关键酶，它可直接影响黑色素的合成［4，5］。其次，氧化与抗氧化失衡可能是产生黄褐斑的重要因素。氧自由基与皮肤黑色素的形成及色素沉着有关［6，7］。MDA可导致蛋白质分子发生交联，形成荧光发色团色素。SOD除能有效清除自由基外，还具有抑制酪氨酸酶的活性，降低色素沉着的作用。大量资料表明，黄褐斑患者血中SOD和过氧化氢酶(CAT)活性显著降低，LPO和MDA含量明显增高。本研究表明，模型组大鼠组织酪氨酸含量均明显升高;大鼠肝脏SOD活力明显降低，皮肤MDA含量明显升高，符合黄褐斑生物化学改变特征。

表2 黄体酮致黄褐斑模型大鼠组织中酷氨酸的质量分数(x±SD) mg·g－1

表3 黄体酮致黄褐斑模型大鼠组织中MDA和SOD含量(x±SD)

表4 黄体酮致黄褐斑模型大鼠黑色素细胞的变化(x±SD)

黄褐斑作为全身性疾病的局部反应，临床资料研究表明黄褐斑患者存在血流动力学指标异常，认为血液流变学改变与黄褐斑关系密切［8］。本次研究检测了血液流变学指标来考察模型是否成功。大鼠造模后全血粘度均有明显升高，其余指标除血浆粘度和红细胞压积外，也均有不同程度的升高，表明该模型与临床研究结果一致。

判断黄褐斑动物模型是否成功最直接、客观的指标，是皮肤病理学检查黑色素沉着是否增多。本实验结果显示，模型组黑色素细胞较正常组明显增多，呈强阳性反应。计算机病理图象学定量分析结果，模型组黑色素着色面积、黑色素细胞数明显大于正常组，黑色素着色深度也明显增加，经统计学处理有显著性差异。说明造模后大鼠表皮黑色素着色面积、深度明显加大。

综上所述，笔者认为用黄体酮注射大鼠复制的黄褐斑模型在临床研究资料、生物化学、病理学指标方面均可靠。黄体酮刺激造成的机体内分泌紊乱不仅使合成黑色素的酪氨酸酶含量增加，它还可能使机体抗氧化能力降低，从而进一步增加酪氨酸酶含量，增加黑色素的生成。本次研究针对目前治疗黄褐斑无确切有效的中西医疗法，建立了可靠的动物模型。

［1］周颖华．黄褐斑病因及发病机理［J］．中外医学研究，2011，9(34):163-164．

［2］覃永健，冯颖颖．中医治疗黄褐斑研究述评［J］．中医学报，2012，27(6):762-764．

［3］张海燕，王军．黄褐斑实验动物模型的应用研究概况［J］．中国民族民间医药，2009(8):41-42．

［4］周继刚，汪鉴植，陈仁美，等．祛斑胶囊治疗黄褐斑的实验研究［J］．湖北中医杂志，2006，28(5):15-17．

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［6］刘邦民，张涓，陶春荣，等．祛斑汤防治黄褐斑的实验研究［J］．中药药理与临床，2008，24(1):67-69．

［7］张子平，施秀明，刘茁，等．色素障碍性皮肤病患者血液SOD、LPO、GSH-PX、GSH测定及意义初探［J］．皮肤病与性病，1997，19(3):8-10．

［8］林新瑜，周光平，李利，等．女性黄褐斑患者的血清酶学及血液流变学初步分析［J］．临床皮肤科杂志，1997，26(6):359-361．