多形拟杆菌对仔猪肠道菌群的影响

蔡艳,胡善辉，付金衡,储玉双,万培伟,黄晓红

（1.江西生物科技职业学院，江西 南昌 330200；2.南昌大学中德联合研究院食品科学与技术国家重点实验室）

拟杆菌(Bacteroidetes)是一种革兰氏阴性,杆状、两端钝圆而浓染，形态一致或多形态的专性厌氧菌。它分离自人和其他动物的自然体腔和昆虫的肠道[1]，拟杆菌是人和动物体内大量存在正常的菌群,约占成年个体内肠道菌群1/4以上[2]，与其他菌群以及和宿主之间有着微妙而复杂的关系,对宿主的健康起着非常重要的作用。

多形拟杆菌广泛分布在哺乳动物体内，是人类和动物肠道的主要细菌之一，常作哺乳动物体细菌的一个代表来研究宿主与微生物之间的营养物质代谢共生关系[3～5]。这种共生关系的研究可以揭示细菌如何影响动物和人体的生物学过程使自身和机体都受益，为动物和人类的健康及营养物质的合理利用提供新线索，并为预防和治疗各种疾病提供新策略[6～9]。

研究表明，多形拟杆菌能够根据食物来源的变化,将自身的基因1/4以上调节到活跃状态[10]。这一发现让科学家对肠道菌群有了更新的认识[11]。每当宿主的食谱变化时，多形拟杆菌就能够迅速调节自己体内的基因组,更好更快地消化新食物，在为宿主提供营养的同时也为自己和肠道中其他的细菌获得食物，这样就维持了整个肠道菌群的健康。此外，多形拟杆菌能降解一类动物和人体所不能被消化的植物多糖，动物和人体肠道几乎不含多糖消化酶,但是多形拟杆菌却能编码64种多糖降解相关的酶,从而降解多糖,为宿主提供了额外的能量[12]。碳水化合物来源的能量,其中有10%～15%依赖于肠道细菌的酵解。实验表明，接种多形拟杆菌10d后的小鼠,其盲肠内己糖的的浓度显著下降[13]，提示细菌可以促进宿主对单糖的吸收。因此,多形拟杆菌对机体糖代谢影响可能是肥胖的另一大诱因。

1 多形拟杆菌的益生作用

对于多形拟杆菌的益生作用，很多国外的学者从不同的方面进行了大量研究，发现多形拟杆菌在帮助宿主吸收多糖以及提高营养利用率、调控脂肪的积累[14]、加快肠道黏膜的血管形成和提高宿主的免疫力、维持肠道微生态平衡等方面均有着非常重要的作用。特别是多形拟杆菌在对多糖的利用方面的作用尤其突出。这一作用不仅赋予了多形拟杆菌更易于利用其他菌不能消耗的多糖能力，也减少了对营养源的竞争，奠定了其优势地位；而且多形拟杆菌在代谢多糖过程中产生的中间产物，还可以为宿主提供营养[15～18]。这一重大发现对研究动物和人体的肥胖有重要的意义。特别在增加猪肉瘦肉率上可供参考。

除此之外，断奶仔猪的腹泻是一个让人头痛的问题，尤其是断奶的仔猪肠道菌群严重失调,功能出现了紊乱,即使使用很多的药物也是无济于事,反而还可能更加破坏肠道的菌群平衡。使用多形拟杆菌可恢复肠道的微生态,使有益菌群快速的增殖从而改善肠道功能,可以有效地解决腹泻的问题。

2 材料与方法

2.1 材料

主要仪器：超净工作台,显微镜,厌氧培养箱,XW～80A漩涡混合器,80-2离心机等。

选择性GAM培养基的配方：大豆胨3.0g,胨10g,多形拟杆菌的发酵提取液5.0g,牛肉膏2.3g,葡萄糖3.0g,磷酸二氢钾2.5g,氯化钠5.0g,可溶性淀粉5.0g,L～Cys盐酸盐0.3g,硫乙醇酸钠0.3g,蒸馏水1 000mL。pH7.4，121℃,高压灭菌20min后,冷却至50℃～60℃,加入无菌氯化血红素0.003g,新霉素0.1 mg/mL,万古霉素0.001mg/mL,卡那霉素0.1mg/mL。

CDC厌氧血琼脂培养基配方：胰酪蛋白胨15.0 g,大豆蛋白胨5.0g,酵母粉5.0g,氯化钠5.0g,L-胱氨酸盐酸盐0.4g,琼脂15.0g,蒸馏水1000mL。pH 7.5,121℃高压灭菌20min后,冷却至45℃～50℃,加入5%无菌羊血、无菌氯化血红素0.005g和无菌维生素K0.01g。

实验动物：体重7kg左右的商品仔猪。

2.2 实验方法

2.2.1 多形拟杆菌的分离与鉴定。从健康猪粪便中提取分离出1株多形拟杆菌,进行耐氧实验、糖发酵试验、胆汁试验、七叶灵试验以及基质试验[18]。

2.2.2 饲养试验及样品采集。将40头28日龄断奶、体重7kg左右的商品仔猪依体重和窝别随机分为4个处理组,每组10头(母猪和去势公猪各半)。饲料喂养，对照组饲喂基础日粮,试验组分别饲各喂添加100mL108cfu/mL，109cfu/mL,1010cfu/mL浓度的目示多形拟杆菌菌液的饲粮。试验猪自由采食和饮水,预试期5d,正试期35d。记录耗料量、空腹始重和末重。每日观察仔猪排粪情况,记录腹泻个体、持续时间。以每重复仔猪发生腹泻的头日数除以总的饲养头日数计算腹泻率。饲养试验结束时,从对照组和其他3组中分别选择体重相近的6头猪(公母各半),前腔静脉采血,分离血清样品,置-20℃冰箱保存,待检。然后全部屠宰,无菌采取结肠内容物作肠道菌群分析[19]。

3 结果

3.1 多形拟杆菌分离与鉴定结果

多形拟杆菌在CDC血琼脂平板上菌落形状如点滴状、细小、圆形、全缘、凸起、半透明、带白色、软而发亮、羊血平板上不溶血,革兰染色后,油镜观察为阴性杆菌,见图1、图2。

图1 多形拟杆菌在CDC血琼脂培养基上的形态

图2 多形拟杆菌在油镜观察下的形态

3.2 生化鉴定实验结果（见表1）

表1 生化鉴定结果

3.3 多形拟杆菌对仔猪肠道菌群的影响

使用SPSS统计软件进行显著性分析，并进行多重比较，测定结果以平均数±标准差（x±s）表示。（见表2）

表2 各组仔猪肠道内容物菌落计数LgCFU/g

4 讨论

从表2可以看出，与空白对照组相比，灌胃多形拟杆菌菌液的3个实验组的拟杆菌数量都增加了，且差异极其显著（P＜0.01）。这说明多形拟杆菌已在仔猪肠道定植，而且已成为一种优势菌群。但是相比对照组的肠道内其他菌群如大肠杆菌，却在减少，显著差异（P＜0.05）。大肠杆菌减少，也有助于预防仔猪腹泻的发生。

与对照组相比，双歧杆菌在3个实验组的数量都增加了，显著差异（P＜0.05）。但是乳酸菌的数量增加不明显，差异不显著（P＞0.05）。

乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌在防病促生长方面具有协同作用。动物肠道内乳酸杆菌等益生菌的增殖,能促进宿主代谢,分解碳水化合物,产生多种有机酸,增加维生素合成,提高机体的消化机能,促进营养物质的吸收,还能竞争性地抑制肠道内有害菌的增殖,外源性多糖、有机酸等营养物质,可促进动物肠道正常微生物菌群的增殖。试验研究结果显示,灌喂多形拟杆菌菌液的仔猪肠道菌群发生了显著地变化,益生菌的数量在增加,致病菌（如大肠杆菌）的数量在减少，维持了仔猪肠道微生态平衡，很可能有助于提高仔猪免疫力和预防仔猪腹泻的发生。

[1]肖珊,张日俊.小鼠低菌模型的构建及多形拟杆菌对其补偿生长作用的研究[J].中国微生态学杂志,2008,20(2):102～104.

[2]吴彦彬,边艳青.拟杆菌与肠道微生态[J].微生物学通报，FEB20,2008,35(2)：281～285.

[3]CHIANG,HOOPERLV,GORDONJI.FuctionaLgenomic andmetaboLicsyudiesoftheadaptationofaprominientaduLt humangutsymbionttothesuckLingperiod[J].JBioLChem,2006,281(47):36269～36279.

[4]陶常义.早期断奶仔猪腹泻的原因分析与营养调控[J].湖南饲料,2003,(2):18～19.

[5]刘威,姚文,朱伟云.人体与肠道微生物间的互惠共生关系[J].世界华人消化杂志,2006,14(1):1081～1088.

[6]李晓娟,赵淑贤,姜玉祥.肠道正常菌群对免疫系统的影响[J].中华临床医学研究杂志,2006,12(13):1820～1821.

[7]赵明晓,贺永亮.肠道细菌与宿主共生的研究进展[J].重庆文理学院学报,2008,27(2):56～59.

[8]王超.人体肠道微生态概述[J].高校理科研究,2002,19(9):96～98.

[9]张锦亮.胃肠道微生物区系在宿主体内共生作用的研究进展[J].渝西学院学报,2005,4(2):46～49.

[10]杨景云.医用微生态学[M].中国医药科技出版社,1997:26～37.

[11]杨景云,苏文金.肠道菌群与健康[M].黑龙江科学技术出版社,1991:65～68.

[12]殷燕,董蕾.肠道微生态与肠易激综合征[J].国际消化病杂志,2006,26(1):43～45.

[13]JustinL.Sonnenburg,JianXu,DougLasD.Leip,etaL.GLycanForaginginVivobyanIntestine～AdaptedBacteriaL Symbiont[J].Science,2005,307:1955～1959.

[14]SamueL,B.S,Gordon,J.I.Ahumanizedgnotobioticmouse modeLofhost～archaeaL～bacteriaLmutuaLism[J].Proc.NatLAcad.Sci.USA,2006,103:10011～10016.

[15]PeterJ.Turnbaugh,RuthE.Ley,MichaeLA.MahowaLd,et aL.Anobesity～associatedgutmicrobiomewithincreased capacityforenergyharvest[J].Nature,2006,444:1027～1031

[16]RuthE.Ley,PeterJ.Turnbaugh,SamueLKLein,etaL.Humangutmicrobesassociatedwithobesity[J].Nature,2006,444:1022～1023.

[17]HOOPERLV,MIDTVEDTMJ,GORDONI.HowhostmicrobiaLinteractionsshapethenutrientenvironmentofthe mammaLianintestine[J].AnnRevNutrit,2002,22(28):2.

[18]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等主编.伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M].北京:科学出版社,1984,(1):535～536.

[19]陈晓明,李肖梁,汤丽萍，等.中草药渣对断奶仔猪生长、肠道菌群和免疫的影响[J].浙江农业学报，2007,19(1):50～54.