356例乙型肝炎患者病毒分型及拉米夫定治疗所致耐药突变株变化分析

李延武,李卓成

(广东省深圳市第二人民医院检验科,广东深圳,518035)

拉米夫定是临床治疗乙肝或抗HBV的新型 药物,为核苷酸类似物及反转录酶抑制剂,能够有效地对HBV的复制过程产生明显地抑制作用。然而,长期地服用拉米夫定,会产生拉米夫定耐药性[1-2]。临床研究[2-3]证实,拉米夫定耐药是HBV病毒逆转录酶编码区发生突变,尤其在HBV聚合酶基因P基因的活性区域氨基酸位点发生变异最为常见。本研究对 2007年8月—2012年8月本院收治的356例乙型肝炎患者的临床资料进行回顾性分析,采用荧光定量PCR结合DNA分子测序技术对其耐药菌株突变情况进行检测和分析,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2007年8月—2012年8月本院收治的乙型肝炎患者356例,其中男221例,女135例;年龄11～75岁,平均(47.02±11.08)岁;诊断均符合2000年全国传染病及寄生虫病分会与肝病学分会修订的病毒性肝炎预防与治疗方案的临床诊断标准[5],服用拉米夫定之前,经检测血清中ALT>80 μ g/L(正 常 值 约 为 40 μ g/L),HBV DNA>106copies/mL,拉米夫定治疗的剂量为80～100 mg/d,排除其他因素引起的肝功损害。

1.2 血清标志物与肝功能检测

血清标志物主要由意大利Alisei全自动酶检测分析仪进行分析、测定,试剂为厦门新创公司所提供,肝功能采用 Beckmann生化分析检测仪(Beckmann公司所提供,检测范围为4.2E+02～4.2E+08[6])。

1.3 HBV P区PCR扩增

PCR反应体系为 25 μ L, 其中有 4 μ L 为HBV-DNA 模 板 ,1 μ L Taq DNA 聚 合 酶 ,为2.5U/μ L,2.5μ L 10 ×PCR缓冲 液 ,2μ L的2.5 mM dNTP,1.5 μ L 的HBV-F1 引物,浓度为10 μ mol/L,1.5 μ L HBV-R1, 浓度为 10 μ mol/L(具体见表1)。扩增条件为:94℃预变性,时间为5 min,于94℃温度条件下边线15 s,60℃温度条件下退火35 s(采集荧光),40个循环,采用美国ABI StepOne荧光定量PCR扩增分析仪进行检测、分析[7]。

表1 HBV引物探针序列

1.4 统计学处理

本研究中的数据均由SPSS 15.0软件加以统计及分析,计量数据采用卡方检验的方法加以计算,计数资料采用配对检验的方法加以计算,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗2～18个月后HBV-DNA、ALT及HBeAg检测结果

拉米夫定治疗 2、6、12、18 个月后 HBVDNA含量、ALT水平均逐渐下降(P<0.05或P<0.01);转阴率、HBeAg复常率及转阴率逐渐升高。见表2。

2.2 门诊乙肝患者与经拉米夫定治疗后乙肝患者HBV基因型之间的关系

门诊检查的乙肝患者与经拉米夫定治疗患者的HBV基因型无显著差异(P>0.05)。见表3。

2.3 经拉米夫定治疗后乙肝患者HBV P区耐药突变点结果

经拉米夫定治疗后,氨基酸位点为204的患者人数最多(21.91%),位点为213的最少(2.25%),见表4。

表2 拉米夫定治疗后HBV-DNA、ALT及HBeAg检测结果[n(%)]

表3 门诊乙肝患者与经拉米夫定治疗后乙肝患者HBV基因型之间的关系[n(%)]

表4 经拉米夫定治疗后乙肝患者HBV P区耐药突变点结果[n=356,n(%)]

3 讨 论

拉米夫定是全新一代核苷类似物,能够有效地抑制HBV反转录酶的表达,其抑制HBV复制作用的机制是药物在细胞内磷酸化之后再与脱氧胞嘧啶核苷之间进行竞争,然后再进入至合成中的eDNA链[8-9],使其不能够继续地延伸而逐渐终止复制过程,从而在很大程度上阻断了HBV复制中的反转录(RNA-DNA)过程,是目前普遍认为的临床治疗慢性乙肝的安全、有效的药物。本研究中,治疗前及治疗后2、6、12及18个月HBV-DNA的含量从(7.22±0.33)copies/mL逐渐降低至(4.02±0.11)copies/mL,治疗后各时点与治疗前HBV-DNA比较差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);ALT水平也随着治疗时间的延长而逐渐降低,由治疗前的(177.19±44.30)U/L逐渐降低至18个月时的(85.56±11.78)U/L,治疗后各时点与治疗前相比,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);HBeAg复常率与转阴率也逐渐上升。

本研究结果表明,门诊乙肝患者HBV B型、C型及D型构成比分别为20.00%、70.83%、9.17%,经拉米夫定治疗患者分别为30.90%、59.55%、9.55%,各个基因型相比,2组差异无统计学意义(P>0.05),此结果与Zoulim F等[10]的研究结果一致。大量实验研究[11-12]证实,发生rtM204I变异或者 rt180M/rtM204V双变异的对拉米夫定耐药的HBV病毒对替比夫定抗病毒效果降低超过约1000倍。本研究所选择的这些经拉米夫定治疗之后的乙肝患者均为拉米夫定治疗超过1年的住院患者,这就说明了经过拉米夫定治疗之后,患者的耐药性较为明显,此时进行拉米夫定耐药检测的价值较大[13]。这些患者之中存在着比较广泛的多位点同时突变的例子,基因序列测定检测的为容易发生突变区域的完整序列[14-15]。本研究结果显示,经拉米夫定治疗后,氨基酸位点为204的患者数最多占21.91%。

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