重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

袁仕善 ，邓志高 ，谭云洪 ，杨 双 ，王 云 ，孙文霞

(1.湖南师范大学医学院分子生物学研究室，湖南 长沙 4100132.湖南省结核病防治研究所检验科，湖南 长沙 410013)

结核病是由结核分枝杆菌感染所致的一种慢性传染病，其中以肺结核(Tuberculosis,TB)最为常见，呈世界性分布，是全球一个重要的公共卫生问题。据世界卫生组织2011年报告，新发肺结核估计有870万例，其中13%共同感染艾滋病病毒；140万人死于结核病[1]。我国目前结核病年发病人数约130万，位居全球第2位[2,3]。尽管近20年来肺结核的控制取得了一些进展，但病例发现仍低于新世纪确定的诊断70%新结核病例的发展目标。2010年中，估计35%结核病人，即总数超过300万感染患者未被诊断[4]。早期诊断结核感染是有效控制结核病的重要途径，而寻找简便、快速、灵敏、特异的诊断方法是控制结核病流行与蔓延的关键。本文克隆和表达结核分枝杆菌6kDa早期分泌抗原靶(ESAT-6)，分析其免疫活性，为其用于结核病诊断奠定基础。其结果报告如下。

1 材料与试剂

1.1 菌株与质粒

结核分枝杆菌标准株H37Rv由湖南省结核病防治所检验科提供；大肠埃希菌E.coli JM109、E.coli BL21及质粒pET-28a为湖南师范大学医学院分子生物学研究室保存。

1.2 试剂

pMD18-T 载 体 、TaqDNA 聚 合 酶 、dNTP、T4DNA连接酶、BamHⅠ、HindⅢ、DNA胶回收纯化试剂盒购自大连宝生物工程公司；质粒DNA小量提取试剂盒、氨苄青霉素(AMP)、卡那霉素(KAN)、标准分子量DNA、标准分子量蛋白、IPTG购于北京鼎国生物技术有限公司；琼脂糖、十二烷基磺酸钠(SDS)购自上海生工生物工程公司；预染标准分子量蛋白购自系美国NEB公司。His-Binding Resin购自美国Novogen公司；硝酸纤维素(NC)膜购自美国Bio-rad公司；HRP标记的羊抗人IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG购于美国PIERCE公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。10例肺结核患者血清取自湖南省结核病防治所检验科，为抗酸杆菌痰涂片阳性，血清抗结核抗体阳性的患者；10例健康者血清取自湖南省人民医院健康体检无异常者。

1.3 方法

1.3.1 结核分枝杆菌基因组DNA的提取

参考Singh S的方法[4]提取结核分枝杆菌基因组DNA。取少量结核分枝杆菌标准株H37Rv菌接种于改良罗氏培养基中，37℃培养2～3周。接种环取2～3环细菌培养物用200μL无菌蒸馏水重悬。沸水浴作用20 min，然后加入200 μL氯仿，漩涡混匀。再于80℃孵育10min，9000 r/m离心2min。结核杆菌H37Rv基因组DNA即存在于上层水相中，-20℃冻存备用。

1.3.2 esat-6基因的扩增与克隆

根据Genbank报道的结核分枝杆菌标准株H37Rv的esat-6基因序列设计并合成如下引物。F:5'-GGATCCATGACAGAGCAGCAGTG-3',R：5'-AAGCTTCTATGCGAACATCCCAG-3'，分别含BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点。以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，建立PCR扩增体系，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 1min，共 30 个循环；72℃终延伸5min。1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离，切取含目的片段的凝胶，用DNA胶回收纯化试剂盒回收纯化，与pMD18-T载体于16℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希菌JM109感受态细胞，AMP抗性平板上筛选，菌落PCR和粒DNA序列分析鉴定。

1.3.3 重组质粒pET28-esat-6的构建

分别扩增esat-6阳性克隆和pET-28a/BL21，碱裂解法提取并纯化esat-6阳性克隆和pET-28a/BL21的质粒。分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，37℃反应过夜。酶切产物1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收酶切后的目的片段和pET-28a载体，将回收的目的片段和酶切回收后的pET-28a载体于16℃连接过夜，连接产物转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，KAN抗性平板筛选阳性重组子，菌落PCR和质粒的BamHⅠ与HindⅢ双酶切鉴定，凝胶成像分析系统照相，记录结果。

1.3.4 ESAT-6蛋白表达与纯化

将构建好的重组表达菌株pET28-esat-6/BL21 于 3mL LB 培养基(含 30μg/mL Kan)中，37℃振荡培养至OD600约0.6，加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)至1.0mmol/L，诱导表达2 h。离心收集菌体，菌体重悬于1xSDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min,离心，收集上清，12%SDSPAGE电泳分离，考马斯亮蓝R-250染色，含10%醋酸的5%甲醇脱色，观察结果，分析ESAT-6的表达。同前，于少量LB培养基 (含30μg/mL Kan)中37℃培养重组表达菌株过夜，放大培养，培养至OD600约0.6 h，加IPTG至 1.0mmol/L，诱导表达4 h。离心收集菌体，菌体重悬于20mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，反复冻融三次，冰浴超声8min(5s/次，间隔 5s)，4℃，12000g 离心 20min，取上清，经Tris-HCl液平衡的His-bindTM柱纯化，参考介质使用说明纯化蛋白，12%SDS-PAGE电泳分析纯化蛋白，western blotting分析ESAT-6的免疫学活性。

2 结果

2.1 esat-6基因的扩增与克隆

以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板，扩增出288bp的esat-6基因片段，与Gen-Bank中报道的esat-6基因大小一致(图1)。重组克隆pMD18-esat-6经菌落PCR鉴定后测序分析，发现其与Genbank中结核分枝杆菌标准株H37Rv的esat-6基因序列完全一致。

2.2 重组pET-esat-6质粒的构建

重组表达质粒pET-esat-6经PCR和双酶切鉴定均获得大小约290bp的片段(图3),提示esat-6基因成功插入表达载体pET-28a。

图2 重组pET-esat-6质粒双酶切和质粒PCR鉴定结果

2.3 重组ESAT-6蛋白的表达与鉴定

经IPGT诱导表达的重组菌株的裂解液经12%SDS-PAGE分离、染色后，在约14 kD处出现一条强的诱导表达带(图3),而未经诱导的重组菌此处的蛋白带较弱；说明重组菌表达了ESAT-6蛋白。

图3 重组ESAT-6蛋白电泳图

2.4 重组ESAT-6蛋白的纯化与鉴定

经IPTG诱导的重组菌裂解上清经HishindTM纯化后，SDS-PAGE显示得到的蛋白为约14kD 的蛋白带(见图 4)；经 western blotting分析,亲和层析纯化后的ESAT-6融合蛋白，能被结核患者血清识别，产生特异反应条带，而不与正常人血清发生反应，提示纯化的蛋白具有良好的抗原活性(图 5)。

图4 纯化ESAT-6蛋白的电泳图谱

图5 纯化ESAT-6蛋白western blotting图谱

3 讨论

随着流动人口的增加、结核/获得性免疫缺陷病毒(TB/HIV)双重感染及结核杆菌耐药菌株的出现，全球结核病疫情恶化。结核病已成为严重危害人类健康的一个公共卫生问题。筛选和鉴定结核分枝杆菌特异的抗原并开展结核病诊断研究，对结核病防治具有重要意义[5]。

结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6是1995年Andersen等在小鼠感染结核分枝杆菌后的记忆性免疫反应模型中发现的一种分泌性抗原，由结核分枝杆菌 RD1位点上的esat-6基因编码，全长95个氨基酸，理论分子量为9.9kD，经 SDS-PAGE测得其分子量为 6kD，故而得名。它在保护性细胞免疫反应中发挥作用，可作为新型结核病疫苗的候选分子。ESAT-6的编码基因存在于结核分枝杆菌RD1区，RD1区仅存在于致病性分枝杆菌包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌，而不存在于卡介苗 (BCG)及其它非致病性分枝杆菌中。ESAT-6可作为诊断结核分枝杆菌感染的特异性抗原[6,7]。

本研究从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增esat-6基因经克隆和测序鉴定后，亚克隆到表达载体pET-28a中，表达的重组蛋白在N端和C端各编码1个组氨酸标签，通过金属螯合亲和层析柱与固定化的Ni2+结合，将重组蛋白予以纯化。研究结果表明，扩增的esat-6基因被亚克隆至表达载体pET-28a中，经IPTG诱导表达了 ESAT-6融合蛋白，通过His-bindTM柱亲和层析获得了重组融合蛋白ESAT-6，纯化蛋白能被结核病患者血清所识别。下一步研究将建立重组ESAT-6检测结核分枝杆菌感染的免疫学诊断方法，为有效防治结核病的提供依据。

[1]World Health Organization.Global tuberculosis report 2012:Executive Summary.Geneva,Switzerland.

[2]唐神结,肖和平.结核病流行趋势及治疗未来展望[J].中国实用内科杂,2012,32(8):565-568.

[3]杨双,袁仕善,谭云洪,等.重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达[J].湖南师范大学学报(医学版),2012,9(3):6-8,13.

[4]Global tuberculosis control 2011.Geneva,Switzerland:World Health Organization,2011.

[5]Inaki C,Sebastien G.The past and future of tuberculosis research[J].PLoS Pathog,2009,5(10):e1000600.

[6]Kaeryn N.Lewis,Reiling Liao,Kristi M.Guinn,et al.Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis Mimics Bacille Calmette-Guerin Attenuatio [J].J Infect Dis,2003,187(1):117-123.

[7]Parkash O,Singh BP,Pai M.Regions of differences encoded antigens as targets for immunodiagnosis of tuberculosis in humans[J].Scand J Immunol,2009,70(4):345-357.