丝线、羊肠线及结扎道数对大鼠CCI疼痛模型的影响

沈立姿，房立丛，于津鹏，胡远艳，朱晓鹏，高炳淼，罗素兰，长孙东亭

(海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海南大学海口市海洋药物重点实验室，海南海口570228)

疼痛是实际的或潜在的组织损伤所引起的一种不愉快的感觉，也是一种预警机制，它可防止机体遭受压迫或进一步损伤.疼痛可分为生理性疼痛和病理性疼痛2种，而后者又可分为炎症性疼痛和神经病理性疼痛.1994年，国际疼痛研究协会［1］(International Association for the Study of Pain，IASP)将其定义为“一种与组织损伤或潜在的与损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验”.

疼痛并不仅仅是一种单一的感觉，它有复杂的发病机制［2－3］.虽然止痛药可以缓解不同类型的疼痛，但它们的作用机理是千差万别的，尤其是神经病理性疼痛，它的发病机制极其复杂，也顽固难愈.有研究表明，炎症介质在神经病理性疼痛中发挥着重要的作用，神经损伤后由于G蛋白偶联受体的作用，神经的敏感性也会增加.突触后膜去极化可以抑制甘氨酸受体激活，从而产生痛觉过敏［4］.1988年BENNET等［5］成功建立了大鼠坐骨神经慢性挤压伤病理性痛模型(chronic constriction nerve injury model，CCI)，为神经病理性疼痛的研究提供了动物模型，并在临床研究中得到广泛的发展和应用.有研究人员采用不同的实验材料对大鼠坐骨神经进行结扎，以研究其对CCI模型的影响.但到目前为止，尚未看到结扎道数对大鼠CCI模型效果差异的相关报道.因此，笔者采用大鼠CCI模型研究了芋螺毒素对神经性疼痛的镇痛药效，分别比较了丝线和铬制羊肠线结扎坐骨神经2，3，4道对疼痛阈值的影响，以期摸索出一种高效、简便的大鼠CCI建模方法.

1 材料与方法

1.1 实验仪器 IITC Electronic von Frey Model 2390 Series(美国IITC公司);4－0号可吸收性外科缝线(山东博达医疗用品有限公司);3－0号非吸收性外科缝线(姜堰市新康丝线厂);Precisa电子天平(Xs 365M-sc);青霉素钠(江西东风药业股份有限公司，批号:110911－2);戊巴比妥钠(Sigma试剂公司，批号059H0612).

1.2 实验动物 清洁级SD雄性大鼠，广东省医学实验动物中心提供，体质量180～220 g.实验动物质量合格证明许可证号:SCXK(粤)2008－0002.

1.3 实验方法 将大鼠随机分成7组，每组6只，适应性喂养3 d，自由摄食和饮水.实验室温度保持在23～25℃.实验大鼠腹腔注射戊巴比妥钠70 mg·kg－1麻醉，当大鼠麻醉完全，痛觉消失后，置于超净工作台上进行无菌手术.手术区域剃毛，局部皮肤碘酊消毒，用φ=70%的乙醇脱碘，逐层切开皮肤、筋膜，钝性分离肌肉，使坐骨神经主干暴露在视野内，用镊子将坐骨神经主干轻轻剥离，在坐骨神经干上每间隔约1 mm处用铬制羊肠线和丝线分别做2，3，4道结扎.在结扎时保持力度一致，结扎强度以不阻断神经血管循环为宜(松紧适宜即可)，逐层缝合肌肉和皮肤，并在缝合前和缝合后的伤口处涂抹青霉素粉末以防术后感染，假手术组只暴露坐骨神经主干，不进行结扎，其余处理同神经结扎组，大鼠右下肢不作任何处理，术后单笼饲养至伤口愈合，自由摄食及饮水.

1.4 机械性缩足反应阈值MWT的测定 MWT测值时间在8:00～18:00之间完成，用Electronic von Frey机械测痛仪测定.将大鼠放置于有机玻璃观察格中，它可以自由活动，观察格则放置在顶层具网眼的金属架上，让其适应15 min，待探觅行为消失后，测痛仪从下向上透过网眼刺激大鼠左后足3次，每次间隔时间为10 min.取3次测量的平均值作为大鼠的痛阈值.术前测量大鼠左后肢的机械痛阈值，手术后7 d，14 d，21 d，用同种方法测量大鼠术后的痛阈值.

1.5 统计分析 所获实验数据采用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)13.0软件做统计学分析.各组术前、术后痛阈值用均数及标准差表示(±s表示，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为极显著性差异)，用Origin软件作图.

2 实验结果

2.1 结扎手术以及结扎道数对大鼠机械痛阈值MWT的影响 每组CCI大鼠在施行坐骨神经结扎手术之前，测定其机械痛阈值MWT，这组数值即为基础痛阈值(表1中的第1列).假手术组的基础痛阈值即为暴露坐骨神经主干操作前的MWT.施行手术后的第7天，分别测定7组大鼠的机械痛阈值，同时观察每组大鼠是否存在自噬现象，其结果如表1所示.在所有大鼠实验组中，只有结扎丝线4道组出现了1只大鼠的自噬现象，其余大鼠均表现正常.只有假手术组在施行手术前后的机械痛阈值MWT没有显著变化，假手术组的基础痛阈值平均为(33.9±3.0)g，暴露坐骨神经主干手术后的痛阈值平均为(34.5±5.0)g，二者之间没有统计学上的差异.而其他施行了结扎手术的CCI组，在结扎前后的痛阈值普遍减小.其中，结扎丝线2道在结扎前后的MWT分别为(33.0±5.3)g和(27.4±3.7)g，结扎前后的MWT平均相差5.6 g，二者差异最小，没有统计学意义.而其余5个CCI组在结扎前后的痛阈值差异很显著，作为神经痛CCI模型都是成功的.结扎丝线3道组在结扎前后的MWT分别为(32.8±5.3)g和(24.1±4.0)g，二者平均相差8.7 g.结扎羊肠线4道组在结扎前后的MWT分别为(34.6±5.1)g和(19.9±3.3)g，二者平均相差14.7 g.其余3个CCI组，即结扎丝线4道组，结扎羊肠线2和3道组，在结扎前后的MWT之间的差异在8.7～14.7 g的范围内，这说明结扎是CCI模型产生神经痛的根本原因，手术的机械操作会自愈，不会对大鼠神经痛产生质的影响.丝线结扎的道数对神经痛的发展有一定的影响，而在羊肠线组中，于2，3，4道组之间进行组间比较时无显著性差异(P＞0.05)，这意味着羊肠线结扎道数(2～4道)对大鼠疼痛阈值的影响不大，且没有自噬现象出现.综上分析比较，坐骨神经结扎2道具有手术易施、简便快速，且对坐骨神经损伤最小等优点，是首选的建模方法.

表1 大鼠坐骨神经结扎前后机械痛阈值的变化±s，g

表1 大鼠坐骨神经结扎前后机械痛阈值的变化±s，g

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，与自身基础比较;#P ＜0.05，##P ＜0.01，与假手术组比较

痛阈值 自噬现象假手术组 33.9 ±3.0 34.5 ±5.0结扎方式 基础痛阈值 结扎后7 d无结扎丝线2道 33.0±5.3 27.4±3.7 无结扎丝线3道 32.8±5.3 24.1±4.0＊＊## 无结扎丝线4 道 33.4 ±5.0 22.7 ±5.2＊＊## 1 只结扎羊肠线2道 34.8±4.5 21.2±3.3＊＊## 无结扎羊肠线3道 34.1±4.2 21.2±3.5＊＊## 无结扎羊肠线4 道 34.6 ±5.1 19.9 ±3.3＊＊##无

2.2 结扎手术后不同时间的机械痛阈值MWT的变化情况 在结扎手术后的第14天与第21天，分别测定各组的机械痛阈值，结果见表2，将基础痛阈值和手术后第7天的痛阈值一起绘制曲线，结果如图2所示.7个组的MWT在术后1周、2周和3周的测定值都没有明显的变化，神经痛模型稳定.例如，假手术组在术后的1，2，3周的MWT平均在33.8～35.2 g之间，几乎没有变化;建模成功的5个CCI组在术后的1，2，3周的MWT差异都不大，平均在0.9～1.8 g范围内，没有统计学上的差异，这说明神经痛在术后的第7天已产生，且持续很久，不会自愈.羊肠线组的神经痛比丝线组略严重，羊肠线组对触觉疼痛更加敏感，也没有出现自噬现象，这可能与羊肠线组有神经痛和炎性痛的双重作用有关.

表2 大鼠坐骨神经结扎后不同时间机械痛阈值的比较±s，g

表2 大鼠坐骨神经结扎后不同时间机械痛阈值的比较±s，g

21 d假手术组结扎方式 结扎后7 d 结扎后14 d 结扎后34.5 ±5.0 33.8 ±4.5 35.2 ±4.0结扎丝线2 道 27.4 ±3.7 28.2 ±4.1 29.8 ±4.7结扎丝线3 道 24.1 ±4.0 24.9 ±5.2 25.5 ±4.1结扎丝线4 道 22.7 ±5.2 21.2 ±5.1 22.1 ±5.9结扎羊肠线2 道 21.2 ±3.3 20.9 ±4.1 20.1 ±4.3结扎羊肠线3 道 21.2 ±3.5 19.4 ±3.7 20.4 ±4.0结扎羊肠线4道19.9 ±3.3 19.8 ±3.8 19.0 ±4.1

图3 丝线、羊肠线及结扎道数对大鼠CCI模型痛阈值的影响（n=6）

3 讨论

神经病理性疼痛包括痛觉过敏(对疼痛刺激的敏感性增加)和痛觉异常(正常情况下无害刺激所诱发的疼痛)2种情况.神经型疼痛往往很顽固，它常给患者带来极大的痛苦，慢性疼痛折磨着约20%的人口［6］，虽然目前有许多止痛药物可用于镇痛，例如阿片类药物，非甾体类抗炎药和各种辅助剂［7］，但这些药物并不能治愈疼痛，并且易产生耐受性，在慢性疼痛患者的治疗过程中往往需要增加药物的剂量才能产生相同的镇痛效果［8］.所以镇痛药物的研究与开发一直是热点，开发出镇痛效果好、无成瘾性的新型镇痛药变得日益重要.

大鼠CCI模型在镇痛药理学研究中是一种常用的动物模型，它能很好地模拟患者由于外周神经损伤所致的神经病理性疼痛.此模型是通过人为地造成慢性压迫坐骨神经，使部分神经系统受到挤压而造成神经水肿，这种损伤短时间内就可以显现出来.参考多篇文献发现，在CCI模型制作过程中多数选用雄性大鼠，推测这是因为成年雌性大鼠在生理周期时激素分泌水平有差别，为避免对实验的准确性造成影响，实验选用了成年雄性大鼠.在神经结扎时，常用的材料主要是羊肠线和丝线2种，羊肠线是一种异体蛋白，在其被组织吸收的过程中，它会使机体发生非特异性炎症反应，铬制羊肠线用铬酸处理过，它不但能减慢组织吸收的速度，还可以增加其抗张强度，延长维持应力的时间.MAVES等［9］认为，由于铬制羊肠线可被机体吸收，它所含的化学物质可使大鼠产生与人类相似的炎性疼痛反应，因此可以认为，CCI模型具有神经病理性疼痛和炎性疼痛的双重成分.而使用丝线结扎神经所致疼痛主要是由于神经压迫所致，没有产生非特异性炎症所致的炎性疼痛因素.在大鼠CCI模型中，结扎材料的不同及结扎道数的不同都会对大鼠CCI模型是否成功产生影响，不管用什么材料来结扎坐骨神经，都是通过挤压神经所致，所以结扎时的力度很重要，一定要把握好，太紧容易阻断神经的血运，太松起不到挤压神经的效果，这一点需要特别注意.TANCK［10］认为，在CCI模型上若实验动物的年龄较大，则不会产生触诱发痛，这会影响实验的准确性.

HAMA等人［11］利用此模型来研究曲马多的镇痛效果是否均衡，药物的作用机理是否随时间的改变而改变.此模型也帮助JOSEPH确定［12］ZZ-204G是一种作用于α9α10乙酰胆碱受体的小分子拮抗剂，是一种新型结构的镇痛剂，它在治疗慢性炎症和神经性疼痛方面有潜在的应用前景.NARMATHA［13］利用大鼠CCI模型确定α－芋螺毒素Vc 1.1可以提高大鼠的痛阈值，并且可通过不同的部位给药(手术侧后肢，对侧后肢)修复大鼠的受损神经，故确定其对大鼠的受损神经有修复作用.RICHARD［14］认为，用未成年大鼠制作CCI模型更易诱发炎性疼痛，与人类新生儿神经受损后的临床表现一致，这有利于研究人员进一步探索神经痛的发病机理和治疗方法.

在神经疼痛模型中也常用到大鼠脊神经结扎(SNL)模型，SNL模型虽然有利于在脊髓水平研究星形胶质细胞和小胶质细胞的变化，但由于其对大鼠的损伤较大而不利于大量制备.WOOLF［15］提出了另外一种制作大鼠疼痛模型的方法，即大鼠坐骨神经分支选择性损伤(SNI)神经病理痛模型，它是通过结扎并剪断坐骨神经分支胫神经、腓总神经，保留并避免损伤腓肠神经来建立的.

镇痛药物的研究是目前医学中最活跃的领域之一，由于疼痛的发病机制极其复杂，因此各种疼痛模型的制备显得尤为重要.在研究神经病理性疼痛的过程中，动物模型的建立、完善及改进也是一个需要解决的关键问题，所以近几年来本实验室在对芋螺毒素镇痛作用研究的过程中也对大鼠的CCI模型进行了适当的改进，分析和比较了改变结扎道数的实验结果.笔者认为，在建立大鼠CCI模型中，首选铬制羊肠线，推荐使用2道结扎法.目前，本实验室正用大鼠CCI模型对被誉为“海洋药物宝库”的海南产芋螺毒素进行镇痛活性的筛选，已筛选出镇痛作用强大、作用靶点清楚、无成瘾性的新型芋螺毒素先导药物，为下一步原创镇痛新药的研发奠定了坚实的基础.

［1］LUIS R，HARALD B，HELGE R，et al.Chronic pain and sensory changes after augmentation mammoplasty:Long term effects of preincisional administration of methylprednisolone［J］.Pain，2006，124:92 －99.

［2］JI R R，KOHNO T，MOORE K A，et al.Central sensitization and LTP:do pain and memory share similar mechanism［J］.Trends Neurosci，2003，26:696 －705.

［3］HERRERO J F，LAIRD J M，LOPEZ-GARCIA J A.Wind-up of spinal cord neurones and pain sensation:much ado about something［J］.Prog Neurobiol，2000，61(2):169 －203.

［4］LAU W K，LAU Y M，ZHANG H Q，et al.Electroacupuncture versus celecoxib for neuropathic pain in rat SNL model［J］.Neuroscience，2010，170(2):655 －661.

［5］BENNETT G J，XIE Y K.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33:67 －107.

［6］BRENNAN F，CARR D B，COUSINS M.Pain management:a fundamental human right［J］.Pain Medicine，2007，105:205 －221.

［7］HOLTMAN J R，DWOSKIN L P，DOWELL C，et al.The novel small molecule α9α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic［J］.Eur J Pharmacol，2011(670):500 － 508.

［8］SOUNVORAVONG S，TAKAHASHI M，NAKASHIMA M N，et al.Disability of development of tolerance to morphine and U-50，488H，a selective κ-opioid receptor agonist，in neuropathic pain model Mice［J］.J Pharmacol Sci，2004(94):305 － 312.

［9］MAVES T J，PECHMAN P S，GEBHART G F，et al.Possible chemical contribution from chromit gut sutures produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1993，54(1):57 －69.

［10］TANCK E N，KROIN J S，MCCARTY R J，el al.Effects of age and size on deveiopment of allodynia in a chronic pain model produced by a sciatic nerve ligation in rats［J］.Pain，1992，51(3):313 －316.

［11］HAMA A，SAGEN J.Altered antinociceptive efficacy of tramadol over time in rats with painful peripheral neuropathy［J］.Eur J Pharmacol，2007，559(1):32 －37.

［12］JOSEPH R H，LINDA P D，CHERYL D，et al.The novel small molecule α9α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic［J］.Eur J Pharmacol，2011，670(2/3):500 －508.

［13］NARMATHA S，BRUCE L，KEN G，et al.Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones［J］.Brain Res，2005，1059:149 － 158.

［14］RICHARD F H，SUELLEN M W，MOTA P M.The ontogeny of neuropathic pain:Postnatal onset of mechanical allodynia in rat spared nerve injury(SNI)and chronic constriction injury(CCI)models［J］.Pain，2005，115(3):382 － 389.

［15］DECOSTERD I，WOOLF C J.Spared nerve injury:an animal model of persistent peripheral neuropathic pain［J］.Pain，2000，87(2):149－158.