低氧诱导肺动脉内皮细胞转分化的初步机制研究

胡义杰，李志平，陈建明，沈 诚，宋 毅，钟前进 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管外科，重庆 400042)

继发性肺动脉高压的主要病理学变化表现为表达α 平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)细胞在增厚的血管壁中大量堆积。但关于这些细胞的来源以及大量堆积的机制尚未完全明确［1］。有研究报道肺动脉血管壁中膜常驻平滑肌细胞去分化［2］;肺血管外膜的成纤维细胞的分化［3-4］;归巢于血管损伤部位的循环祖细胞分化。因此这些表达α-SMA表型的成肌纤维细胞具有高度的异质性，其来源可能复杂多样［5］;这也可能是目前临床药物治疗效果欠佳的重要原因。近年来有报道认为在肾脏纤维化和心肌纤维化过程中存在内皮细胞向平滑肌样细胞或成肌纤维细胞的转分化［6-7］。那内皮细胞的转分化是否也是肺动脉高压形成中肺动脉壁重塑的机制之一呢?因此本研究以低氧性肺动脉高压为基本模型，细胞水平对低氧培养肺动脉内皮细胞表型变化及TGF-β1在此过程中的作用进行了探索。

1 材料与方法

1.1 肺动脉内皮细胞的原代培养

健康6周左右SPF级SD大鼠(第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物房)，皮下注射戊巴比妥钠70 mg/kg麻醉。碘伏消毒固定大鼠的胸腹部。剪开下腹部腹腔，并沿正中线上延手术切口至颈部，同时打开腹腔和胸腔，暴露出心肺组织。前下提起心肺，剪断主动脉;切除心脏，显露主肺动脉和左右肺动脉干。顺肺动脉干方向，切除肺组织和血管外膜，尽可能多的保留肺动脉并注意避免损伤肺动脉内膜。将PBS清洗的节段肺动脉血管，锐性切成小肺血管片。肺动脉内膜面贴壁培养于含10%胎牛血清(Hyclone公司，美国)和支原体去除剂MRA 50 μl(Mpbio公司，美国)的 DMEM/F12培养基中，于5%CO2、37℃培养箱中孵育。48～72 h后，去除血管片并继续培养、传代。选择第3～4代状态好的肺动脉内皮细胞继续后续试验。

1.2 肺动脉内皮细胞的低氧培养诱导转分化

取对数生长期的肺动脉内皮细胞，做细胞爬片。将细胞爬片和处于对数生长期的细胞放入低氧培养箱(含1%O2、5%CO2、94%N2混合气体)、37℃恒温孵育。每两天给细胞换液，并在低氧培养1 d、4 d、7 d时观察细胞形态，与常氧培养的细胞比较。低氧培养7 d结束后，细胞爬片用4%中性甲醛固定后4℃保存备用。收取常氧培养和低氧培养的肺动脉内皮细胞，抽提总mRNA和总蛋白样本并放－80℃保存备用。取出固定的细胞爬片，PBS洗3次，用0.1%Triton通透15 min，再用PBS洗3次，anti-α-SMA孵育过夜，PBS洗3次后再孵育对应二抗1 h，PBS洗3次后DAB显色3 min，用PBS洗去DAB后用中性树脂封片。晾干后去照相。

1.3 TGF-β1及其抑制剂调节转分化实验分组

大鼠肺动脉内皮细胞在常氧培养下不同浓度TGF-β1及其抑制剂刺激后比较各组α-SMA蛋白表达差异。取对数生长期的细胞和细胞爬片，按下列条件分别给予刺激。刺激72 h后，抽提总蛋白样本并放－80℃保存备用。TGF-β1刺激组:①正常对照;②1 ng/mL TGF-β1;③5 ng/mL TGF-β1;④10 ng/mL TGF-β1;⑤50 ng/mL TGF-β1。在最佳 TGF-β1 刺激浓度基础上，设定TGF-β1/SD-208刺激分组:①低氧实验组;②常氧组;③SD-208 0.5 μM 刺激组;④SD-208 0.5 μM+ 最佳浓度 TGF-β1刺激组;⑤最佳浓度TGF-β1刺激组。

1.4 TGF-β1 mRNA、蛋白表达和 α-SMA 蛋白水平

用Trizol一步法提取总RNA。反转录采用2 ug总RNA。常规RT-PCR分析TGF-β1 mRNA的水平。TGF-β1 cDNA的引物:上游引物5’-GCCCCTACATTTGGAGCCTG-3’，下游引物5’-CAGGAGCGCACGATCATGT-3’。内参 β-actin引物为:上游引物 5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’，下游引物 5’-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3’。BCA法检测总蛋白浓度。10%SDSPAGE胶电泳，电转NC膜，封闭后加anti-TGF-β1抗体或antiα-SMA及对应的二抗免疫印迹检测TGF-β1或α-SMA蛋白的表达。

2 结果

2.1 低氧原代培养肺动脉内皮细胞转分化为平滑肌样细胞

肺动脉内皮细胞经贴壁纯化和传代培养后，呈现内皮细胞典型的铺路石样生长(图1)。随着低氧培养时间的延长，铺路石样内皮细胞逐步向多角形细胞改变。免疫细胞化学染色可见α-SMA高表达的平滑肌样细胞改变(图2)。

2.2 TGF-β对肺动脉内皮细胞转分化的影响

低氧培养7 d细胞TGF-β1 mRNA表达水平和蛋白表达水平都高于正常氧浓度培养组(图3)。随着TGF-β1刺激浓度的增加，细胞表达α-SMA的水平逐步增加(图4A)。10 ng/mL TGF-β1刺激可见α-SMA较前增加明显，因此将其设为后续实验的最佳刺激浓度。单纯10 ng/mL TGF-β1刺激与低氧所致的α-SMA水平增加相似;在予以TGF-β1抑制剂SD-208后，可见α-SMA表达水平几乎恢复正常;单独的SD-208对α-SMA表达并无显著影响。

图1 贴壁培养的肺动脉内皮细胞(×10倍)

图2 低氧培养7 d后肺动脉内皮细胞转分化为α-SMA高表达的平滑肌样细胞(×40倍)

图3 低氧培养7 d后细胞TGF-β1表达水平高于正常组

图4 不同刺激条件对肺动脉内皮细胞α-SMA表达的影响

3 讨论

肺动脉高压中重塑血管壁组织细胞来源和机制至今尚未完全明确。结合已有研究对心脏、肾脏血管内皮细胞转分化现象的认识，本研究证实贴壁培养的肺动脉内皮细胞在低氧培养条件下，能向平滑肌样细胞转分化;且TGF-β1在低氧诱导的肺动脉内皮细胞转分化过程中具有重要意义。

稳定培养肺动脉内皮细胞是研究其转分化现象的基础。目前肺动脉内皮细胞分离培养，主要有酶消化法、切碎并酶消化法、磁珠分离法、组织贴壁培养法。本实验采用了组织贴壁法。通过多次差速贴壁，呈铺路石样生长的内皮细胞相对纯化，在第3～4代培养后纯度约98%，为实验的稳定开展提供了基础。

近年来越来越多的证据提示成熟的血管内皮细胞存在转分化现象。在心血管发育过程中，房室管区域内皮细胞表型(CD31)的心内膜细胞逐步分化为间质细胞的心内膜垫内皮细胞［8］。内皮细胞转分化现象也是心肌纤维化、肾脏纤维化过程甚至肿瘤进展的重要机制之一。在Cre-lox基因标记的小鼠心肌纤维化模型中发现27%～33%的成纤维细胞起源于内皮细胞［7］。在多个肾脏纤维化模型中，近30% ～50%的成纤维细胞同时表达内皮细胞表型CD31和成纤维特异蛋白或α-SMA;而采用内皮细胞系示踪系统证实内皮细胞转分化［9］。在肿瘤进展中发挥重要作用的成纤维细胞，其来源也可能与内皮细胞的转分化相关［10］。本实验证实肺动脉内皮细胞在低氧培养7 d后，铺路石样生长肺动脉内皮细胞向多角形的α-SMA高表达的平滑肌样细胞转分化。这种内皮细胞转分化来源的细胞可能是血管壁重塑的重要机制之一。

TGF-β1在机体的损伤修复、炎症反应、组织纤维化和肿瘤血管形成等过程发挥重要作用。近来研究证实TGF-β1在心脏、肾脏等多种组织的内皮细胞转分化过程中具有重要作用［9-11］。本研究证实低氧能上调TGF-β1的表达水平;而TGF-β1能刺激肺动脉内皮细胞向平滑肌样细胞的转分化，抑制TGF-β1能减少肺动脉内皮细胞的转分化。故推测低氧性肺动脉高压形成的机制是通过TGF-β1信号通路实现的。在其他内皮细胞转分化模型中发现TGF-β1可能通过多种机制实现转分化。心肌纤维化模型中，miR-125b能降低p53表达水平，抑制 TGF-β1介导的内皮细胞转分化［12］;单独miR-21的过表达可以刺激内皮细胞的转分化，而沉默miR21可以降低心肌纤维化［13］。rhBMP可以拮抗TGF-β1，减轻心肌纤维化［7］。在低氧性肺动脉高压中TGF-β1调节肺动脉内皮细胞转分化的机制尚需更深入的实验予以阐明。

我们的研究为肺动脉高压异构肺血管壁来源和机制提供了实验依据，对临床防治肺动脉高压提供了新思路。但TGF-β1在肺动脉内皮细胞转分化过程的作用机制十分复杂，还有待进一步的研究才能全面阐明。

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