伸筋草氯仿提取物对佐剂性关节炎大鼠血清RF、TNF－α、IL－1β、IL－6含量的影响

敖鹏，周忠光，韩玉生，尹丽颖，边晓燕

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

随着类风湿性关节炎的基础和临床研究，滑膜病变与细胞免疫、体液免疫的关系得到了进一步的明确［1－2］。绝大多数患者不仅血清类风湿因子(RF)含量升高，且TNF－α、IL－1β、IL－6等细胞因子含量亦升高，这些细胞因子则是 RA发病的重要因素［3－4］。本项目在研究了伸筋草乙醇和正丁醇提取物对AA大鼠血清RF、TNF－α、IL－1β、IL－6含量影响的基础上［5－7］，研究氯仿提取物对上述各因子的影响，进一步探讨伸筋草不同有效部位治疗类风湿性关节炎的作用及免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂

伸筋草氯仿提取物(黑龙江中医药大学实验中心制备);甲氨喋呤(广州石歧制药厂);弗式完全佐剂(美国sigma公司);RF ELISA试剂盒(上海华壹生物科技有限公司);TNF－α、IL－1β、IL－6放射免疫试剂盒(北京福瑞生物工程公司)。

1.2 主要仪器

Stat Fax2100型酶标仪(美国TEC HONLOGYIN公司);γ放免计数器(GC－2016型，科大创新股份中佳公司)。

1.3 动物与分组

Wistar大鼠50只，清洁级，2～3月龄，雌雄各半，体质量(180±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。50只大鼠适应性喂养1周后，随机分成5组，即正常对照组、模型组、西药对照组(甲氨喋呤MTX组)、伸筋草氯仿提取物高剂量治疗组(伸氯高组)、伸筋草氯仿提取物低剂量治疗组(伸氯低组)。

1.4 造模与给药

除正常对照组外，各实验组采用CFA制造佐剂性关节炎大鼠模型。参照文献方法［5－9］:实验第1天，各实验组大鼠于右后足跖部位皮下注射弗式完全佐剂0.1mL/只，然后在尾巴1/3交界处皮下再注射弗式完全佐剂0.05mL/只;正常对照组注射等量的生理盐水。

实验第8天开始灌胃给药。伸氯高组和伸氯低组分别灌服伸筋草氯仿提取物混悬液，每日1次，每次1mL，连续服药 21天，其中伸氯高组含生药量1 600 mg/mL(8.89g/kg/d);伸氯低组含生药量800mg/mL(4.44g/kg/d);MTX组，每周灌服MTX混悬液1次，每次1mL，浓度为1.5mg/kg/w;正常对照组和模型组灌服等量蒸馏水。

1.5 取材与检测

于药物治疗21天后，每只大鼠分别采血3mL，3 000r/min离心10min，分离血清，置－20℃冰箱保存。采用ELISA法检测RF，放射性免疫法检测TNF－α、IL－1β和IL－6。

1.6 统计学处理

经上述方法检测的各组数据，应用 SPSS 20.0统计学软件进行统计，以均数±标准差(±s)表示，组间数据比较采用t检验。

2 结果

2.1 伸筋草氯仿提取物对AA大鼠血清RF含量的影响

应用ELISA法检测各组大鼠血清RF含量，检测结果见表1。

表1 各实验组大鼠血清RF检测结果(±s)

表1 各实验组大鼠血清RF检测结果(±s)

注:与正常组相比，△△P＜0.01;与模型组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

分组 n RF(pg/mL)10 33.67 ±3.51模型组 10 81.92 ±3.86△△MTX 组 10 75.34 ±6.55*伸氯高组 10 55.76 ±7.08＊＊伸氯低组 10 66.14 ±5.14正常对照组＊＊

表1所示，模型组与正常对照组相比，AA大鼠血清RF含量明显增高，差异具有显著意义(P＜0.01);西药组(MTX)与模型组相比，AA大鼠血清RF含量有所降低，差异具有统计学意义(P＜0.05);中药伸氯高组和伸氯低组与模型组相比，AA大鼠血清RF含量均明显降低，差异具有显著性意义(P＜0.01)。

2.2 伸筋草氯仿提取物对 AA大鼠血清TNF－α、IL－1β和IL－6含量的影响

应用放射性免疫法检测TNF－α、IL－1β和IL－6含量，检测结果见表2。

表2 各实验组大鼠血清细胞因子的水平(n=10，±s)

表2 各实验组大鼠血清细胞因子的水平(n=10，±s)

注:与正常组相比，△△P＜0.01;与模型组相比，＊＊P＜0.01，*P＜0.05，#P＞0.05。

分组 TNF－α(ng/mL)IL－1β(ng/mL) IL－6(pg/mL)正常对照组0.243 ±0.042 0.159 ±0.034 87.51 ±3.86模型组 0.340 ±0.035△△0.267 ±0.039△△ 136.63 ±7.85△△MTX 组 0.260 ±0.035＊＊0.184 ±0.042＊＊ 100.44 ±20.71＊＊伸氯高组 0.264 ±0.020＊＊0.187 ±0.041＊＊ 123.30 ±8.28*伸氯低组 0.280 ±0.054* 0.211 ±0.065* 130.55 ±22.17#

表2所示，模型组与正常组相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β和IL－6含量均升高，差异具有显著性意义(P＜0.01);西药组(MTX)与模型组相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6含量降低，差异具有显著性意义(P＜0.01);中药伸氯高组与模型组相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6含量均有明显降低，差异具有显著性意义(P＜0.01或P＜0.05);伸氯低组与模型组相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β含量降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而IL－6含量无明显改善(P＞0.05)。

3 讨论

伸筋草常被临床用于治疗风寒湿痹、关节酸痛和跌打损伤等疾病，具有消肿镇痛、舒筋活络等功效［10］。现代研究表明，伸筋草主要含有石松碱、棒石松碱、石松灵碱等生物碱成分;伸筋草醇、石松醇、芒柄花醇等三萜化合物;还含有少量的蒽醌类成分和挥发油类［11］。

近年文献多有报道，RA的发病不但与类风湿因子有关，而且与机体细胞因子水平失调密切相关。TNF－α和IL－1β常同时分泌及升高，在RA关节滑膜病变中起到共同致炎作用;IL－6的升高则能促进B细胞合成RF及产生免疫球蛋白［12－13］。

本项目的前期研究工作已经证实，AA模型大鼠血清中RF、TNF－α、IL－1β和IL－6等细胞因子的含量明显升高，且造成关节局部炎性细胞浸润，大鼠机体处于免疫失调状态，导致关节炎发病;伸筋草乙醇、正丁醇提取物均能有效降低上述指标［5－7］，同时还应用透射电子显微镜观察到伸筋草醇提物能够有效控制AA 大鼠关节滑膜的病理改变［14－15］。

结合项目的前期报导和上述实验结果，伸筋草提取物，无论是乙醇提取物、正丁醇提取物还是氯仿提取物，对AA大鼠血清RF皆有明显的抑制作用并且其作用优于西药组，作用效果依次为乙醇提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、MTX;对于TNF－α，三种提取物作用相近，均能明显降低其含量;对于IL－1β，三种提取物均有明显的抑制作用，其中乙醇提取物、氯仿提取物高剂量、正丁醇提取物高剂量优于氯仿提取物低剂量和正丁醇提取物低剂量;对于IL－6，乙醇提取物与正丁醇提取物的抑制作用优于氯仿提取物的作用。

上述结论说明，伸筋草不同提取物均能有效降低血清中细胞因子TNF－α、IL－1β和IL－6的含量，更能明显降低RF的水平，达到减少关节炎症、预防和治疗类风湿关节炎的目的。伸筋草药源丰富，价格低廉，且无明显的毒副作用，具有临床应用价值，因此对其防治类风湿性关节炎的其它免疫机制有待进一步深入研究。

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