不同因素对灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量影响研究

莫 娟，邹 凯，肖志翔，李冠华，丁文兵，李有志

（(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙410128；2.邵阳县烟草公司，湖南 邵阳422100；3.湖南省农业厅，湖南 长沙410005）

灰毛豆（Tephrosia purpurea）为豆科灰毛豆属 植物，又名野青树等。该植物主要分布于东南亚等国和中国的福建、海南、广东、广西、云南、湖南等地。在巴基斯坦，该植物是一种传统草药植物，常作为利尿剂和通便剂使用[1]。国外曾从医用的角度研究了该植物地上部分乙醇提取物对老鼠免疫功能的影响[2]，并从灰毛豆种子和根中分离出几个黄酮类化合物[3-4]；李有志等[5]曾报道该植物甲醇提取物对多种害虫具有毒杀活性，并分离鉴定了该植物树皮中的主要杀虫成分[6]。此后，李冠华等[7-8]又进一步研究了该植物种子甲醇提取物对白背飞虱和谷蠹的毒杀活性，并报道该植物种子中的杀虫成分及其杀虫活性[9]。湖南农业大学昆虫研究所已利用该植物中主要杀虫成分开发植物源杀虫剂10%12α-羟基鱼藤酮EC，现已大面积推广使用[10]。试验研究了灰毛豆不同品种树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量、含量与生长期的关系以及不同生态条件和施肥措施对灰毛豆树皮中该化合物含量的影响，以期为该杀虫植物的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

从海南、广西、广东、湖南和江西等地采集16个野生灰毛豆品种的种子。试验中所用肥料尿素、硫酸钾和磷酸氢钙均从试验点附近农资市场上购买。液相色谱串联四级杆质谱联用仪（Triple Quad LC/MS/MS，美国Agilent公司，6410B）；ZORBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm，美国Agilent公司）；Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm，美国Agilent公司）和ZORBAX Extend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5μm，美国Agilent公司）；氮吹仪（Organomation Associate）；十二孔固相萃取装置（美国Supelco公司）；佛罗里硅土（Florisil）固相萃取柱（1 g/6mL）（美国Sepax公司）。

1.2 试验方法

（1）12α-羟基鱼藤酮含量的检测。提取方法同相关文献[5-6]，12α-羟基鱼藤酮含量检测采用王苏宁[11]建立的液相色谱-串联质谱法检测。

（2）灰毛豆不同品种树皮中12-a羟基鱼藤酮含量的检测。在2011年1月初分别在广东、广西、湖南、江西等16个野生灰毛豆品种采集地播种，待其苗出土后用标签标记播种时间，分别于2011年和2012年的11月中旬采集该植物树皮，阴干、粉碎后供12α-羟基鱼藤酮含量检测。其提取、检测方法见（1）。

（3）不同树龄灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮含量的检测。在湖南省江华县大石桥乡种植收集的16个野生灰毛豆品种（图1），于2011年1月初播种，仅保留出苗时间在2011年1月10日至2011年1月15日间的树苗，并用标签标明每棵树苗的出苗时间及品种名称。从树苗苗龄8个月开始于每月的25日收集不同品种的树皮，将其阴干后供检测树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量。其提取、检测方法同（1）。

（4）施用不同肥料对灰毛豆中12α-羟基鱼藤酮含量及产量的影响。灰毛豆种植地点为湖南省江华县大石桥乡，土地为当地多年种植水稻的稻田，灰毛豆选择地方品种广西2号。试验设4个处理，即尿素5 kg/667m2、硫酸钾5 kg/667m2、磷酸氢钙20 kg/667m2和空白对照（完全不使用前述3种肥料），采用完全随机区组排列，重复4次。每小区面积25 m2，小区间挖25 cm深的排水沟，所用肥料在平整土地时作为基肥使用。2012年1月17日播种，待灰毛豆树苗株高约20 cm后间苗，保留有效苗数量为20株/m2，分布较均匀，2012年11月9日采收灰毛豆树苗地上部分枝条（离地面约3cm处砍断），分别收集各小区灰毛豆地上部分并将其阴干，除掉叶片后称重，分别统计不同小区灰毛豆地上部分茎干枝条的生物量（干重）。按方法（1）粉碎、提取、检测提取物中的12α-羟基鱼藤酮，计算不同处理中12α-羟基鱼藤酮的产量。

（5）数据统计分析。利用DPS数据处理系统[12]软件（Version 9.5）进行统计，统计分析中百分比数据经反正弦平方根转换，均值差异显著性通过Duncan’s新复极差法进行多重分析比较。

2 结果与分析

2.1 不同品种灰毛豆树皮中12-a羟基鱼藤酮的含量

从表1中看出，一年树龄的灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮含量在0.22%～5.95%之间，不同品种灰毛豆树皮中该化合物含量差异显著（P<0.05），含量最高的是广西2号（5.95%），其次是海南1号（3.09%）；两年树龄的灰毛豆树皮中该化合物含量在0.23%～6.01%之间，含量最高的仍然是广西2号（6.01%），其次是海南1号（3.16%）。这表明，不同品种树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量差异较大。

2.2 不同树龄灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量

16个灰毛豆地方品种不同树龄树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量变化如图1。这些品种树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量呈现相同的规律，当树龄11月内时，树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量逐渐升高，在11月树龄树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量接近最高值，此后树皮中该化合物的含量基本稳定。在这16个地方品种中，广西2号中的12α-羟基鱼藤酮的含量最高，其次是广西3号。进一步的方差分析结果表明，广西2号树皮中该化合物的含量远高于其它地方品种树皮中的含量（P<0.01）。

表1 灰毛豆不同品种树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量（%）

图1 16个灰毛豆品种不同树龄树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量

2.3 不同肥料对灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮含量及产量的影响

从不同处理对灰毛豆地上部分的生物量来看，施用不同肥料对灰毛豆地上部分生物量有显著的影响（表2），3个处理的生物量均显著高于对照（P<0.05），其中施用肥料磷酸氢钙后的地上部分生物量最高。由此可见，施用这3种肥料均可提高该植物地上部分的生物量。从施用不同肥料对该植物树皮中12α-羟基鱼藤酮含量的影响来看，施用磷酸氢钙后树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量显著高于另外两个处理和对照组中该化合物的含量，而施用尿素和硫酸钾后，树皮中该化合物的含量和对照组中的含量差异不显著（P＞0.05），可见施用磷酸氢钙能显著提高该植物树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量。从施用不同肥料对12α-羟基鱼藤酮产量的影响来看，不同处理间12α-羟基鱼藤酮的产量差异显著，3个肥料处理中12α-羟基鱼藤酮的产量均显著高于空白对照组中该化合物的含量（P<0.05）。施用磷酸氢钙、尿素和硫酸钾处理后，该化合 物 的 产 量 依 次 是75.33、66.34、64.26 kg/667m2（表2），可见这3种肥料均能显著提高12α-羟基鱼藤酮的产量，其中提高幅度最大的是磷酸氢钙。

表2 不同施肥处理对灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮含量及产量的影响

3 结论与讨论

3.1 小结

不同品种树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量差异较大，广西2号品种是一种适宜在湖南江华推广种植的杀虫资源植物，其最佳采收时期为11月；施用磷酸氢钙有利于提高该植物中12α-羟基鱼藤酮的含量和产量。

3.2 讨论

（1）适宜推广种植的灰毛豆品种及最佳采收期。植物中次生代谢产物含量除与该植物遗传基础有关外，通常还受生长地生态条件和采集时间的影响，不同地点采集的同种植物中各化合物的含量可能不同[13]。16个灰毛豆品种树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量不同，这表明不同品种的遗传基础确实存在差异。研究结果还表明，灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量也与生长地的生态条件有关，如品种海南1号种植在江华和原产地海南时，树龄为11个月时树皮中该化合物的含量分别是2.03%和3.09%，两者间差异显著（t测验，P<0.05）。这表明，在开发利用杀虫植物灰毛豆时，应先试种，确定最佳品种后方可大规模种植。

广西2号不论是在原产地海南，还是在被引种到湖南江华种植，树皮中该化合物的含量均显著高于其他品种树皮中的含量。可见，从开发利用该植物树皮中12α-羟基鱼藤酮的角度而言，广西2号是一种适宜在湖南江华推广种植的灰毛豆品种。

灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量与灰毛豆的树龄密切相关，当树龄在11个月以前，树皮中该化合物的含量升高较快；在11个月后，树皮中该化合物的含量趋于稳定。根据试验结果，湖南江华1月人工种植灰毛豆的最佳采集时间为11月，此时该植物树皮中的12α-羟基鱼藤酮的含量已趋向稳定，接近最高值。

（2）栽培措施对灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮含量及产量的影响。原材料供应不足以及植物材料中活性成分含量低等，是当前制约植物源杀虫剂产业化的重要因素之一。人工种植杀虫植物是缓解原材料供应不足的主动措施，是获得优质原材料的重要途径。在人工种植过程中如何通过栽培管理措施调控目标产物向高产方向发展，是灰毛豆栽培过程中值得研究的问题。研究结果表明，尽管灰毛豆树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量受其遗传基础决定，但通过施肥措施可提高该化合物的产量，施用磷酸氢钙可以提高该植物地上部分的生物量，更重要的是可显著提高树皮中12α-羟基鱼藤酮的含量，大幅度地提高该化合物的产量，这对开发12α-羟基鱼藤酮植物源杀虫剂来说具有重要意义。迄今为止，尚无通过施肥措施提高该植物中代谢产物的研究报道，有关施用磷酸氢钙提高12α-羟基鱼藤酮含量的机制尚不清楚，有待进一步研究。为促进利用该植物开发植物源杀虫剂12α-羟基鱼藤酮，探讨如何通过合理密植、加强肥水管理来提高该植物中12α-羟基鱼藤酮的产量，规范灰毛豆的人工栽培措施是值得进一步研究的问题。

[1]Ahmad V U，Ali Z，Hussaini S R，et al.Flavonoids of Tephrosia purpurea[J].Fitoterapia，1999，70：443-445.

[2]Damre A S，Gokhale A B，Phadke A S，et al.Studies on the immunomodulatory activity of flavonoidal fraction of Tephrosia purpurea[J].Fitoterapia，2003，74：257-261.

[3]Gupta D K，Krishnamurti M，Parthasarathi L.Purpurin，a new flavanone from Tephrosia purpurea seeds[J].Phytochemistry，1980，19（6）：1264.

[4]Venkata R E，Ranga R N.Two flavonoids from Tephrosia purpurea[J].Phytochemistry，1984，23（10）：2339-2342.

[5]李有志，黄素青，徐汉虹.灰毛豆甲醇提取物的杀虫活性[J].昆虫知识，2007，44（5）：680-684.

[6]Li Y Z，Li G H，Wei X Y，et al.Isolation and identification of the insecticidal compounds from Tephrosia purpurea barks and their insecticidal activity[J].昆虫学报，2011，54（12）：1368-1376.

[7]李冠华，王苏宁，曾东强，等.灰毛豆种子甲醇提取物对谷蠹的杀虫活性[J]．湖南农业大学学报（自然科学版），2011，37（2）：181-184.

[8]李冠华，刘双清，曹 杨，等.灰毛豆种子甲醇提取物对白背飞虱天敌黑肩绿盲蝽捕食能力的影响[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2011，37（5）：503-506.

[9]李冠华，王苏宁，丁文兵，等.灰毛豆种子中化学成分的鉴定及其对黑翅土白蚁的毒杀活性[J].中国生物防治学报，2013，29（2）：200-206.

[10]黄小清，李求清，周志成，等.10%12α-羟基鱼藤酮乳油对4种十字花科蔬菜害虫的防治效果[J].湖南农业科学，2009，（11）：68-70.

[11]王苏宁，李冠华，李有志，等.固相萃取-高效液相色谱-紫外检测青菜中鱼藤酮的残留动态[J].农药，2012，51（4）：286，278-280.

[12]唐启义，冯明光.实用统计分析及其DPS数据处理系统[M].北京：科学出版社，2011.

[13]陈业高.植物化学成分[M].北京：化学工业出版社，2004.