胶质瘤干细胞与WNT信号通路

毛星刚，章 薇，章 翔

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是人类最常见的原发性脑恶性肿瘤，其发生年龄较大，平均发病年龄约62岁。GBM分为原发性和继发性，前者为原位发生，不表现低度病变恶性前期的征兆;后者由低级别胶质细胞瘤发展而来。目前认为二者具有不同的发病机制，绝大多数(95%)GBM属于原发性，继发性者很少见(5%)。GBM呈现浸润性生长，瘤细胞向正常脑组织广泛浸润，导致手术难以完全切除，且它对放、化疗具有一定抵抗性，其中位生存期只有15个月左右。目前针对GBM的治疗措施包括手术切除和术后辅以放、化疗［1］。GBM的生长特点使其治疗后复发率较高，因而对该类肿瘤生物学特性和分子调控机制研究一直是神经肿瘤学界的热点课题。

1 GBM临床及分子特点

典型GBM的MRI影像学表现具有不清晰的边缘，实体部分信号不均匀(图1)。其组织学特点是血管增生明显，坏死区域细胞可形成假性栅栏样(pseudopalisading)结构。GBM常见的基因突变包括10 q杂合子丢失(70%)，表皮生长因子受体(EGFR)扩增(36%)，p16INK4A缺失(31%)，PTEN 突变(25%)，p53突变(35%)等。近年来全基因组测序研究认为，GBM中常见的突变主要涉及到3个信号通路［2］:①RTK/RAS/PI(3)K 通路，其突变涉及生长因子受体家族(EGFR、ERBB2、PDGFRA、MET)，NF1，PTEN，RAS，PI(3)K，AKT，FOXO 等;②p53信号通路，其突变与 CDKN2A(ARF)，MDM2，MDM4，TP53等有关;③RB信号通路，其突变与CDKN2A(P16/INK4A)，CDKN2B，CDKN2C，CDK4，CCND2，CDK6，RB1等相关。通常情况下，多数肿瘤的突变涉及到2个或2个以上的通路。

图1 的头颅MRI扫描肿瘤位于左额颞叶(箭头所示)，其影像学特点表现为不清晰的边缘，实体部分信号不均匀

2 肿瘤干细胞

近年来，肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)理论指出，肿瘤是一种异质性组织，其中肿瘤细胞存在等级关系，一部分细胞具有更强的致瘤能力，称之为肿瘤干细胞，并可分化为其它非肿瘤干细胞。CSC概念最早在白血病中形成并逐渐成熟［3］，其后在多种肿瘤组织中分离出了 CSCs，包括脑肿瘤［4，5］、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌和甲状腺癌等。

对于CSC的理论在GBM展开了广泛而深入的研究。许多研究表明，从胶质瘤中可分离出类似正常神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的细胞，这些细胞表达干细胞标记物Nestin或CD133，并可分化为神经元及胶质细胞等成熟细胞;这部分的少量细胞即可在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤［4，6］。结合CSC理论，该类细胞被称之为胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)。目前常用的 GSC标记物是CD133，但针对CD133能否作为GSC的标记物尚存争议。有研究发现存在一部分CD133阴性的GSCs，采用其它干细胞标记物(如CD15)可分离出CD133 阴性的 GSC［7，8］。进一步的研究指出，胶质细胞瘤中CD133阳性和阴性的GSC同时存在，这些CD133阳性和阴性的GSC均可产生CD133阳性和阴性的子代细胞［9］，因而提出CD133虽是重要的干细胞分子，但并非特异性的GSC标记物。

另一较常用的GSC标记物分子是CD15，它也是NSC表面标记物。CD15阳性的GBM细胞具有GSC特征，且CD15+细胞在体内较CD15－细胞具有更高的致瘤性。另外，存在部分CD15+CD133－的干细胞，这些细胞同样具有GSC的特性，包括自我更新、多分化潜能及体内致瘤性等［7，8］。值得注意的是，研究发现CD15也可作为髓母细胞瘤CSC的标记物［10］，这提示CD15可能是多种组织中共有的干细胞标记物。

3 GSC的分子调控机制

鉴于GSC对GBM致瘤性的重要性，对GSC生物学特征及分子调控机制的研究是目前的重要研究方向之一。GSC的干细胞状态维持受到多个分子及信号通路的调控，这些分子及调控通路多与干细胞及多潜能性相关。多个与干细胞相关的分子在GSC呈高表达，可调控GSC的干细胞状态，并促进其肿瘤性质的维持。例如GSC通常存在于一个缺氧环境之中［11～13］，缺氧诱导因子是GSC维持干性(stemness)的重要调节分子［13］;ZNF217作为分化抑制因子可促进干细胞状态的维持，其在GSC高表达并可促进GSC的致瘤性［12］。目前发现越来越多的干细胞相关因子与GSC的肿瘤干细胞状态维持和/或致瘤性有关，包括 SOX2、BMI1、EZH2、MET、PLAGL2、ID1等［14］。另外，与干细胞自我更新及增殖有密切关系的信号通路参与了GSC的干性维持及致瘤性，包括 TGF－β、Notch、Sonic Hedgehog、EGFR、WNT、Stat3、BMP 等［15，16］。这些结果表明，促进干细胞维持及细胞增殖的分子或信号通路活性在GSC中明显增高。一些研究指出，WNT通路的激活对维持GSC的肿瘤干细胞特征和致瘤性至关重要。因此，深入研究这些分子和通路对GSC的影响，将为进一步了解GSC的生物学特征、制定新的治疗策略提供明确的方向。

4 WNT信号通路

WNT通路是细胞增殖、分化、发育的重要通路［17，18］。在发现 WNT 与肿瘤关系之前，有关 WNT功能研究主要集中在发育方面(与生物体节发育的关系)。WNT的名称来源是两个同源基因Int(integration 1)和Wg(Wingless)的合称，这两个基因最初发现分别与小鼠中枢神经系统发育及果蝇的翅膀发育有关。之后陆续发现了WNT经典通路各个部分的分子，包括 WNT配体、Frizzled(FZD)受体、LRP共受体、降解复合物、转录因子β－Catenin和TCF/LEF等［17，18］。此外，WNT 还可通过不依赖于 β －Catenin的非经典通路(平面细胞极化通路和钙离子相关通路)发挥作用。

WNT信号通路是干细胞维持的关键通路之一［17，18］。WNT 不仅在多潜能干细胞、NSCs、造血干细胞等多种干细胞的多潜能性中起到关键作用，且在多种肿瘤的发生及CSC的致瘤性中亦起重要作用［18］。经典的WNT通路起始于配体与膜受体的结合，WNT配体分子(WNT3、WNT5A等)与受体(Frizzled，FZD1，FZD7，FZD2，FZD4 等)结合之后，可激活下游通路，导致转录因子β－Catenin稳定并转入细胞核，最终通过转录调控调节众多靶基因的表达。WNT受体未激活时，β－Catenin位于细胞浆内，并与骨架蛋白APC、Axin、激酶CKI和GSK3β形成复合物。在此复合物内，激酶CKI和GSK3β可降解β－Catenin。WNT配体与Frizzled受体家族及LRP5/6/arrow共受体结合后，APC/Axin/CK1/GSK3β降解复合活性受到抑制，从而释放出β－Catenin，使其在细胞质中聚集并转入细胞核，与TCF/LEF转录因子相互作用而激活下游基因的表达。在β－Catenin未进入细胞核时，TCF/LEF转录因子结合于WNT靶基因、并抑制其表达。β－Catenin与TCF/LEF的结合提供了一个激活结构域，这样可以导致转录的激活。

WNT的一个重要调节分子及受体是LGR孤受体家族(LGR4、LGR5和 LGR6)及其配体 R－spondin(Rspo)蛋白(包括 RSPO1－4)［17，18］。LGR5是重要的干细胞标记物，在多种组织及肿瘤发生(包括胶质细胞瘤)中发挥重要作用［17～20］。LGR5可直接与FZD及LRP受体复合物作用，当RSPO蛋白与LGR受体结合后，对FZD及LRP受体复合物产生影响，可增加WNT通路的活性，从而起到调节WNT 通路活性的作用［17，18］。

与大多数信号通路相类似，WNT通路的激活起始于受体复合物空间构象的变化［18］。大多数信号通路的激活过程多由逐级放大的传导信号构成(如激酶)。而WNT信号则不同，由于其激活的过程需要将负性调节因子Axin从降解复合物中分离出来，因而，其信号的激活过程呈现为滴度依赖性，而非逐级放大的级联反应［18］。WNT的这一特点，也决定了其信号传导过程调节的精密性与复杂性。

5 WNT通路在GSC中的调节作用

WNT通路在干细胞及发育中发挥了重要作用，它与肿瘤的关系，早期较明确的发现于结肠癌［17，18］。在正常细胞中，其通路活性受到多个水平及分子的严密调控，从而确保正常细胞增殖与分化的动态平衡。而在肿瘤细胞中，WNT通路的某一调控环节出现异常，会导致细胞增殖与分化的不平衡。WNT活性分子的过表达或激活突变、WNT抑制因子的失活或失活突变，均会使WNT通路不恰当激活，致使细胞异常增殖而发生肿瘤。绝大多数结肠－直肠癌患者具有WNT抑制因子APC的失活［21］。作为β－Catenin降解复合物的重要成员，APC失活可导致β－Catenin稳定性增加，使进入细胞核内与TCF形成转录复合物而激活下游基因。由于WNT通路对肿瘤发生及干细胞的重要性，近年来，越来越多的研究证明，WNT通路在胶质瘤发生及GSC的干性维持等多方面发挥了积极作用［22～24］。

首先，WNT通路中的多个正性及负性调节因子在胶质细胞瘤中表达异常，提示WNT的异常激活。WNT信号通路的关键下游转录因子β－Catenin在GBM 中表达增高［25，26］，且其高表达患者预后差［26］。WNT通路激活过程中，β－Catenin在向细胞核的转入过程依赖于另外一个转录因子FoxM1，而FoxM1也高表达于GBM，且其细胞核内表达水平与β－Catenin呈正相关［23］。此外，WNT通路中的多个活性分子均在GBM中高表达，包括配体分子WNT1、WNT2［25］、WNT3A［27］、WNT5 a［25，28］，受 体 分 子FZD2［25］、FZD4［29］、FZD9［30］，WNT 正性调节分子FRAT1等。同时，WNT通路的很多负性调节分子在GBM中表达降低或有启动子区甲基化，故可促进WNT通路的激活 (如 DKK1、SFRP1、WIF1等)［31，32］。

第二，WNT通路中的多个分子(如正性和负性调节分子)，可影响GSC的多方面生物学特性。抑制WNT配体分子WNT1、WNT3A可抑制GSC增殖、迁徙能力及其化疗的抵抗性，并可抑制其体内致瘤性［27］。沉默 WNT2、WNT3A 及 WNT5可抑制胶质瘤细胞系增殖及体内活性，且它们还可通过PI3K/AKT 通路发挥作用［25，28］。WNT 受体 FZD4 及与FZD蛋白相关作用的分子DVL，亦系促进GSC肿瘤干细胞性质、侵袭性及体内致瘤性的重要分子［29，33］，并可促进 GSC 上皮细胞间质转化(epithelial－to－mesenchymal transition，EMT)调节分子的表达(如 SNAI1、ZEB1、Twist、N－Cadherin 等)［29，34］。影响β－Catenin/TCF转录复合物活性的分子PYGO2，也是调节胶质瘤细胞系增殖的重要分子，其可调节 WNT 靶基因 cyclin D1(CCND1)［35］。WNT 通路的另一正性调节分子FRAT1也是促进胶质瘤细胞系增殖、侵袭及致瘤性的重要分子［36］。调节WNT通路活性的干细胞因子 LGR5也参与调节GSC的肿瘤干细胞性质［19，20］。对于GBM中表达降低的WNT抑制分子WIF1、DKK1等，在GSC及胶质瘤细胞系中过表达此类分子时，可促进WNT通路的激活，并抑制GSC的干性及致瘤性［37，38］。值得注意的是，WIF1可诱导胶质瘤细胞的老化，且WIF1抑制GBM细胞致瘤性及促进其老化的效果是有剂量依赖性的［38］，符合WNT通路激活的滴度依赖性质［18］。WNT通路也是参与GSC放、化疗抵抗性的重要信号通路［27，39］。

第三，WNT通路可与多个信号通路及GSC调节分子相互作用，在肿瘤能量代谢、表观遗传学修饰等之间有着密切联系，并参与对GSC致瘤性的调节。WNT信号通路具有广泛的作用，其在GBM尚可受到其它多个分子或信号通路的调节，如AURKA通过增加β－Catenin的稳定性促进GSC的干性维持及致瘤性［40］;WNT可作为癌基因MET的下游通路促进GSC的干性维持及致瘤性［41］;癌基因Moesin可与WNT/β－Catenin相互作用促进GSC的致瘤性［42］。ASCL1可通过抑制DKK1加强WNT通路的激活，从而促进GSC的肿瘤干细胞性质和致瘤性［43］。WNT还与其它信号通路之间有密切的相互作用，如EGFR通路激活可促进β－Catenin聚集并向细胞核内转移，促进 WNT靶基因表达(如CCND1)［44］。EGFR 对 β －Catenin发挥作用的效果是通过促进PKM2向核内转移而达到的［44］。PKM2是参与肿瘤能量代谢(Warburg effect)的关键分子，在胶质细胞瘤的发病机制中起重要作用。PKM2可与组蛋白H3直接作用导致其T11的磷酸化，随之促使HDAC3从CCND1、MYC等靶基因的启动子区解离出来，以及组蛋白H3的K9位乙酰化，进而激活靶基因表达而促进肿瘤的增殖与致瘤性。

6 展望

WNT通路的多成分分子在GBM及GSC中表达异常，且促进WNT激活的分子在GBM及GSC中高表达，可增进GSC的肿瘤干细胞性质及致瘤性;同样，WNT通路抑制分子可抑制GSC的致瘤性。WNT与其它通路及干细胞相关分子之间的广泛作用，进一步提示WNT在GSC的中的重要性。这表明WNT通路是抑制GSC、治疗GBM的重要靶点。由于WNT通路组成及功能的复杂性，进一步深入探索WNT在GBM及GSC中的作用及机制，以及WNT与其它通路之间的相互关系，将为理解GBM发病机制、制定以WNT通路为靶点的措施提供实验理论依据。

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