黑曲霉M8固态发酵槐米对高尿酸血症小鼠的影响

孙 红， 王昌禄， 李贞景， 杨朝晖， 崔海燕， 陈勉华， 王玉荣

(天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457)

黑曲霉M8固态发酵槐米对高尿酸血症小鼠的影响

孙 红， 王昌禄*， 李贞景， 杨朝晖， 崔海燕， 陈勉华， 王玉荣

(天津科技大学食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457)

以槐米为原料进行黑曲霉固态发酵，HPLC法测定槐米发酵前后槲皮素质量分数变化，研究了槐米发酵物对高尿酸血症小鼠的血尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平的影响.结果表明:经黑曲霉M8菌株固态发酵后，槐米中有95.62%的芦丁转化为槲皮素，槲皮素质量分数由发酵前3.28 mg/g提高到39.23 mg/g，是发酵前的11.96倍.槐米发酵物高剂量组(400 mg/kg)和低剂量组(200 mg/kg)可分别使高尿酸小鼠SUA值降低24.37%，17.96%，与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05);而未发酵的槐米组(400 mg/kg)仅使小鼠SUA值降低2.23%，与模型组相比，无显著性差异(P＞0.05)，表明黑曲霉发酵槐米的降尿酸作用效果优于未发酵槐米.此外，槐米发酵物能显著降低高尿酸血症模型小鼠BUN、SCr值(P＜0.05)，可减轻造模药物对小鼠肾功能的损伤.急性毒理实验证明，槐米黑曲霉发酵物安全.

槐米;黑曲霉;固态发酵;槲皮素;高尿酸血症

*王昌禄，男，教授，博士生导师，主要从事食品生物技术方面的研究.通讯作者.

槐米(Flos Sophorae)，别名白槐、槐花米、槐子，为豆科植物槐(sophorae japonical)的花蕾，是药食同源的保健佳品［1］，具有凉血止血、清肝泻火的功效.槐米中含有芦丁(rutin)、鞣质、植物甾类、槐米花甲素、槐米花乙素、槐米花丙素等成分［2－3］.其中，芦丁(又名芸香苷)为主要功能性成分，临床用于治疗烧伤、关节炎及各种血管疾病.槲皮素(quercetin)是芦丁的水解产物，具有抗炎、抗氧化、凋亡诱导、抗癌等多种生物学活性［4－8］.此外，姚芳芳等［9］研究表明，槲皮素能显著降低高尿酸血症大鼠的血清尿酸水平.

研究表明，芦丁进入肠道后，可被肠道微生物所产生的β-葡萄糖苷酶和α-鼠李糖苷酶水解为槲皮素而发挥药效.传统常采用酸水解方法从芦丁中制备槲皮素，该方法槲皮素得率偏低，酸用量大，对环境有一定影响.Andlauer等［10］通过某些微生物的转化，可使槐米中的芦丁转化为槲皮素.黑曲霉是重要的工业发酵菌种［11］，能利用槐米中的氨基酸、微量元素等营养元素生长繁殖，产生糖苷酶将苷降解成苷元.

高尿酸血症(hyperuricemia)是一种嘌呤代谢障碍疾病，体内的嘌呤底物经过黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)催化作用形成尿酸，传统的降尿酸药物如别嘌呤醇、丙磺舒、苯溴马隆等毒副作用明显，对肝肾等功能有一定程度的损害［12－13］，很多学者开始从中草药中寻找低毒高效的高尿酸血症治疗药物.

本研究将以传统中草药——槐米为原料，通过黑曲霉M8固态发酵，使芦丁转化成槲皮素.利用槐米发酵物对氧嗪酸钾建模的高尿酸血症小鼠进行灌胃实验，研究槐米发酵物对高尿酸血症小鼠血尿酸(serum uric acid，SUA)、尿素氮值(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)水平的影响，通过急性毒理试验检验槐米发酵物的安全性，为将其开发成降尿酸功能性产品提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发酵菌种

菌种为天津科技大学实验室保藏的黑曲霉菌种，编号M8.

1.1.2 材料与试剂

槐米，安徽省亳州市永刚饮片有限公司;芦丁标准品(≥99%)，中国药品生物制品检定所;槲皮素标准品(≥98%)，上海源叶生物科技有限公司;别嘌呤醇片，广东彼迪药业有限公司;氧嗪酸钾，上海生工生物工程技术服务有限公司;尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)试剂盒，南京建成生物工程研究所.

1.1.3 实验动物

实验用清洁级雄性ICR品系小鼠，质量为30±5 g，由中国军事医学科学院提供，合格证号:SCXK－(军)2007－006.

1.1.4 实验仪器

HOG－S36型恒温培养振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司;1200型高效液相色谱仪(配有紫外检测器、荧光检测器和B.04.03.SP 187色谱工作站)，美国 Agilent Technologies公司;J－26 XP型高速冷冻离心机，美国Beckman Coulte公司;DGG－101－2B型电热鼓风干燥箱，天津市天宇实验仪器有限公司;Mulitiskan Spectrum 1500型全波长酶标仪，美国Thermo公司.

1.2 方法

1.2.1 发酵实验

将槐米粉碎后过100目筛，利用黑曲霉M8进行固态发酵.通过单因素条件优化，确定发酵条件为:在250 mL三角瓶中加5.0 g槐米粉，20 mL察氏培养基无机盐混合溶液，4 mL黑曲霉M8悬浮液，30℃，180 r/min 摇床条件下培养 7 d［14］.

1.2.2 槲皮素与芦丁质量分数的测定

色谱柱:Hypersil ODS2(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱温:25℃;流动相:甲醇－水(60∶40)，磷酸(色谱纯)调 pH 值至 3.5;流速:1 mL/min［15］;检测器:紫外检测器;检测波长:365 nm;进样量:20 μL.

分别配制质量浓度为 5，10，15，20，25 μg/mL 芦丁、槲皮素标准品溶液，以质量浓度(Y)对峰面积(X)进行回归计算.

式中:A1为发酵前芦丁质量分数，mg/g;A2为发酵后芦丁质量分数，mg/g.

1.2.3 动物实验

分别将黑曲霉发酵后的槐米样品和未经过发酵的槐米样品干燥后粉碎，过100目筛，以0.5%CMC-Na为溶剂，配制槐米组、槐米发酵物低剂量组和槐米发酵物高剂量组的灌胃样品.

将48只质量为30±5 g的ICR品系清洁级雄性小鼠随机分为6组，每组8只，分别设为正常组、模型组、别嘌呤醇组、发酵物高剂量组、发酵物低剂量组、槐米组.正常组(0.5%的CMC-Na 0.3 mL/d)，模型组(氧嗪酸钾250 mg/(kg·d))，别嘌呤醇组(别嘌呤醇 40 mg/(kg·d))，发酵物低剂量组(200 mg/(kg·d))，发酵物高剂量组(400 mg/(kg·d))，槐米组(400 mg/(kg·d)).将小鼠在动物房适应性喂养7 d，从第8 d开始对小鼠进行灌胃实验［16］.每天上午9点进行灌胃，灌胃前0.5 h禁水、禁食.采用氧嗪酸钾建模法，除正常组(0.5%的CMC-Na 0.3 mL/d)外，每组按照氧嗪酸钾250 mg/(kg·d)的剂量给药建模.氧嗪酸钾给药0.5 h后，按照上述各组实验规定的剂量给药，连续灌胃7 d.

1.2.4 小鼠取血与生理指标检验

在最后1 d灌胃2 h后，采用眼球取血法取血，然后将小鼠断颈处死.将收集的血液在4℃条件下，以3 500 r/min离心10 min，取上清液.将上清液在4℃条件下以3 500 r/min再次离心10 min，取上清液，置－20℃冰箱保藏，备用.按照试剂盒说明书方法测定SUA、BUN及SCr水平.

2 结果与分析

2.1 芦丁和槲皮素质量分数的测定结果

采用HPLC法测定槐米发酵前后芦丁和槲皮素质量分数的变化.其结果如图1(a)、(b).

根据芦丁和槲皮素标准品液相色谱测定结果，芦丁、槲皮素标准品的出峰时间分别在3.1 min和5.3 min左右.

由图1(a)、(b)可以看出:黑曲霉发酵槐米样品中第一个峰的保留时间为3.1 min左右，第二个峰的保留时间为5.3 min左右.出峰时间分别与芦丁、槲皮素标准品出峰时间一致，可以确定这两种物质分别为芦丁和槲皮素.

分别以芦丁和槲皮素的质量浓度(Y)对峰面积(X)作回归计算，结果表明:在5～25 μg/mL范围内，芦丁和槲皮素均有着良好的线性关系，回归方程分别为Y=0.075 9X－1.983 9，R2=0.999 9;Y=0.023 6X+0.447 9，R2=0.999 7.根据芦丁和槲皮素的线性方程，计算出槐米黑曲霉发酵物中芦丁和槲皮素的质量分数.槐米发酵前后芦丁和槲皮素质量分数变化见图2.

图1 槐米经黑曲霉发酵前、发酵后HPLC图Fig.1 HPLC of Flos Sophorae before and after being fermented by Aspergillus niger

图2 槐米发酵前后芦丁、槲皮素质量分数变化Fig.2 Mass fraction changes of rutin and quercetin of Flos Sophorae

由图2可以看出，黑曲霉M8固态发酵槐米前，样品中芦丁的质量分数较高，槲皮素的质量分数较低，根据芦丁和槲皮素的线性回归方程计算得出，芦丁和槲皮素的质量分数分别为88.27 mg/g和3.28 mg/g;经黑曲霉发酵后，槐米样品中芦丁的质量分数降低为3.87 mg/g，槲皮素的质量分数则明显升高，达到39.23 mg/g，是发酵前槲皮素的11.96倍.槐米经黑曲霉发酵后，有95.62%的芦丁被转化为槲皮素.研究表明，微生物利用槐米中的氨基酸、蛋白质、微量元素等多种营养成分生长繁殖，并产生糖苷酶将苷降解生成苷元［17］.本实验结果证明，经黑曲霉固态发酵，槐米中的大部分芦丁被转化成槲皮素.这很可能是由于黑曲霉在生长过程中产生糖苷酶，将芦丁水解为槲皮素，提高了槐米发酵物中槲皮素的质量分数.

2.2 动物实验结果

采用SPSS Statistics 17.0软件进行单因素方差分析，结果以±S表示.组间两两比较采用LSD(L)和S－N－K(S)检验.检验水平 α=0.05;α=0.01.槐米发酵物对高尿酸血症小鼠的SUA、BUN、SCr水平的影响结果见表1.

表1 高尿酸血症小鼠SUA、BUN、SCr的测定结果Tab.1 Results of SUA、BUN、SCr in hyperuricemia mice

由表1可知，经氧嗪酸钾(250 mg/kg)灌胃7 d后，模型组SUA值均明显升高，与正常组的SUA值相比有极显著性差异(P＜0.01)，说明小鼠高尿酸血症模型建模成功.

由表1可知，槐米发酵物高剂量组的SUA值(29.52±3.91 mg/L)与模型组(39.03±4.68 mg/L)有极显著差异(P＜0.01);槐米发酵物低剂量组(32.02±4.44 mg/L)与模型组有显著性差异(P＜0.05);而槐米组SUA值(38.16±5.20 mg/L)与模型组相比无显著性差异(P＞0.05).槐米发酵物高、低剂量组分别使高尿酸小鼠的 SUA值降低24.37%、17.96%，而槐米组仅使其 SUA值降低2.23%.说明槐米发酵物能显著降低高尿酸血症小鼠SUA值，作用效果优于未经过发酵的槐米.

SCr和BUN是检测肾功能的基本指标.与正常组相比，模型组SCr、BUN值均有升高，有极显著差异(P＜0.01)，说明造模药物会对小鼠肾功能造成一定程度损害.槐米发酵物高、低剂量组的SCr、BUN值与模型组相比均有极显著性差异(P＜0.01)，与正常组相比，无显著性差异(P＞0.05)，说明槐米发酵物高、低剂量组对氧嗪酸钾造成的肾功能损伤具有一定的保护作用.

Mo等［18］研究发现，黄酮类物质能够降低氧嗪酸钾所致高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平.本实验结果表明，槐米经黑曲霉固态发酵后，发酵物能够有效的降低高尿酸血症小鼠的SUA、BUN、SCr水平.这可能是因为经过黑曲霉固态发酵，发酵物中槲皮素的质量分数明显增多，槲皮素通过抑制黄嘌呤氧化酶(XO)的活性，减少高尿酸血症小鼠体内尿酸的形成，从而降低小鼠的SUA、BUN、SCr水平.此外，槲皮素还具有一定的抗氧化作用，能够清除体内的自由基，这对降低高尿酸血症小鼠SUA、BUN、SCr水平有一定的作用.

2.3 急性毒理实验结果

急性毒理实验主要是探究化学物的致死剂量，以初步评估其对人类可能造成毒害的危险性.它是一次性投入较大剂量后观察动物的变化，观察期大约为1周，判定动物的致死量(LD)和半致死量(LD50).

GB/T 15193.3—2003规定，如果投药量大于5 000 mg/kg，无死亡，可以认为该品毒性较低，无需再做致死量精确测定［19］.对小鼠进行一次性灌胃侵染实验后，每2 d观察一次小鼠的活动状况.小鼠灌胃后的活动状况见表2.

表2 小鼠活动状况Tab.2 Activity status of mice

实验结果表明，经一次性大剂量灌胃侵染后，各组小鼠的表现无明显差异，均能进行正常活动.

每周称取各组小鼠的体重，各组小鼠体重取平均值.小鼠体重变化情况见图3.

图3 小鼠体重的变化情况Fig.3 Change of weight of mice

由图3可知，各实验组和正常组小鼠的体重有增加，无显著性差异(P＞0.05)，说明槐米黑曲霉发酵物对小鼠体重无影响.根据小鼠经一次性大剂量灌胃侵染实验后的活性情况和体重变化，按照GB/T 15193.3—2003规定，可认为槐米黑曲霉发酵物安全.

3 结论

本研究对黑曲霉固态发酵前后，槐米中芦丁和槲皮素的质量分数变化进行了研究，结果表明:经黑曲霉固态发酵，槐米中的芦丁被水解为槲皮素，槲皮素的质量分数达到39.23 mg/g，是发酵前的11.96倍.进一步研究槐米发酵物对高尿酸血症小鼠的影响，结果表明:槐米发酵物高、低剂量组均能显著降低高尿酸血症小鼠的SUA值(P＜0.05)，而未经发酵的槐米组则不能显著降低高尿酸血症小鼠SUA值.同时，槐米发酵物高、低剂量组能极显著降低高尿素血症小鼠BUN、SCr(P＜0.01)，减轻氧嗪酸钾造成的肾功能损伤.因此，槐米经黑曲霉固态发酵后，对高尿酸血症小鼠的作用效果优于未经过发酵的槐米.同时，急性毒理实验证明，大剂量的槐米黑曲霉固态发酵物对小鼠的活动状态和体重均无明显影响，可认为槐米发酵物安全.

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Effects of Flos Sophorae’s Solid-state Fermention by Aspergillus niger M8 on Hyperuricemia Mice

SUN Hong， WANG Chang-lu*， LI Zhen-jing， YANG Zhao-hui， CUI Hai-yan，CHEN Mian-hua，WANG Yu-rong
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457，China)

Flos Sophorawas used as a raw material for solid-state fermentation byAspergillus nigerM8，and changes of quercetin contents inFlos Sophorabefore and after being fermented were tested by HPLC.The results showed that after solid-state fermentation ofFlos SophorabyAspergillus nigerM8，most of the rutin(95.62%)was transformed to quercetin and the quercetin content was increased from 3.28 mg/g to 39.23 mg/g，which was 11.96 times higher than unfermentedFlos Sophora.The serum uric acid(SUA)content of mice treated by different doses(400 mg/kg and 200 mg/kg)of fermentedFlos Sophorawas decreased 24.37%and 17.96%，which was significantly(P＜0.05)lower than that in the model group.However，the SUA content of mice treated by the high does of unfermentedFlos Sophora(400 mg/kg)was only 2.23%lower than that of the control group.The results demonstrated that the solid-state fermentation byAspergillus nigerM8 could improve the reducing-SUA activity ofFlos Sophora.Moreover，the blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)contents in fermentedFlos Sophoratreatment groups were significantly(P＜0.05)lower than these in the model group，which indicated that fermentedFlos Sophoracould reduce the injury of drugs on mice kidneys.In addition，the safety of the product was tested by the acute toxicological experiment.

Flos Sophorae;Aspergillus niger;solid-state fermentation;quercetin;hyperuricemia

编者按:天然食品中含有多种具有生物活性的功能保健成分，是近年来食品科学研究的热点领域之一.“黑曲霉M8固态发酵槐米对高尿酸血症小鼠的影响”一文，研究了以槐米为原料进行黑曲霉固态发酵使芦丁转化成槲皮素，并进行了槐米发酵物对高尿酸血症小鼠的影响实验，研究表明槐米发酵物能显著降低小鼠实验性高尿酸血症，对进一步开发槐米保健食品提供了一定的理论依据及技术支持.“荭草素和异荭草素抗氧化活性及对肝癌细胞增殖的影响”一文，对于广泛存在于苦菜、荞麦、山楂和竹笋等食品中的黄酮类物质荭草素和异荭草素的抗氧化及抑制癌细胞增殖活性进行了较系统研究，对于富含该类成分的食品及其活性成分的开发利用具有重要意义.“鲢鱼鱼鳞胶原蛋白肽抗氧化作用研究”一文，利用富含胶原蛋白的鱼类加工副产物鱼鳞、鱼皮、鱼骨制备抗氧化活性肽，并进行了抗氧化活性评价，对于水产品副产物高附加值开发利用具有实际指导意义.(栏目主持人:李建科教授)

TS201

A

2095-6002(2013)06-0015-06

孙 红，王昌禄，李贞景，等.黑曲霉M8固态发酵槐米对高尿酸血症小鼠的影响.食品科学技术学报，2013，31(6):15－20.

SUN Hong，WANG Chang-lu，LI Zhen-jing，et al.Effects of Flos Sophorae’s Solid-state Fermention by Aspergillus niger M8 on Hyperuricemia Mice.Journal of Food Science and Technology，2013，31(6):15 －20.

2013-01-22

孙 红，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术;

(责任编辑:叶红波)