复方妥曲珠利缓释微囊的药效试验

高荣琨，钱锐，赵昕，郑明学

（山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030801）

鸡球虫病（coccidiosis）是由顶复器门艾美耳属的几种细胞内寄生性原虫引起的鸡疫病的总称［1］，由艾美耳球虫中的一种或几种寄生于鸡肠道黏膜上皮引起的一种寄生性原虫病［2］，是造成现代养禽业经济损失最大的疾病之一。据统计，球虫病每年给全世界养鸡业造成80亿美元的经济损失。其中柔嫩艾美尔球虫病最为严重，主要引起鸡盲肠和附近区域组织的严重出血，雏鸡排新鲜血便，之后盲肠排便完全停止，耐过的病鸡长期不能康复，增重下降，生长发育严重受阻，成鸡较少发病，但可成为带虫者，感染后其体质和产卵能力均可受到影响［3，4］。

抗球虫药物是防治球虫病的主要手段，尽管一些抗球虫药的使用促进了养鸡业的发展，但长期使用也暴露了它的缺点［5］。首先，长期使用同一种药物或者长期使用低浓度的抗球虫药物，很容易促使耐药球虫株的出现。其次，药物对免疫的影响和残留也是目前存在的问题。再次，抗球虫药主要是通过杀灭或抑制球虫的繁殖来达到抗球虫目的，它们只能对球虫发育的早期或中期（无性繁殖期）起作用，而对出现血便后球虫的有性繁殖期及抗损伤作用甚微或无作用。生产中一般发现血便，才知道鸡患了球虫病，但此时，球虫已处于发育的有性繁殖期，抗球虫药收效甚微，因而鸡球虫病死亡率居高不下，给养鸡业造成惨重损失。

由于药物在球虫病防治中具有重要的地位，且新药相对老药对球虫较为敏感，抗球虫指数高，短期内不易产生耐药性，所以需要新的、高效的抗球虫药物出现，以满足市场的需求。为此，课题组［6］研制了具有抗球虫和抗损伤作用的高效复方抗球虫药——复方妥曲珠利缓释微囊（磺胺对甲氧嘧啶、甲氧苄啶、妥曲珠利、硝苯地、维生素E等），并对其最佳剂量进行了选择。为了延长该复方药在肠道（盲肠）的存留和作用时间，保持有效药物浓度，提高药效，减少给药次数和便于饮水给药，本试验通过对复方妥曲珠利缓释微囊对鸡球虫病的治疗效果及给药频率的研究，为临床合理应用该药提供理论基础和实验依据。

1 试验材料

1.1 试验虫株

柔嫩艾美耳球虫强毒株（Etsx01，2010004），山西农业大学动物科技学院动物病理实验室提供。

1.2 试验动物

1日龄海兰白小公雏，购自山西省太谷县第一种鸡场，在无球虫环境中饲养，饲料经高压灭菌后使用，饮水为清洁凉开水，试验前7天经粪便检查，确认无球虫感染后作为试验用鸡。

1.3 主要药品与试剂

复方妥曲珠利缓释微囊（山西农业大学兽医病理实验室，批号：091105）；B型明胶（化学纯 国药集团化学试剂有限公司，批号：F20081016）；戊二醛（分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20060715）；无水硫酸钠（分析纯 天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：091010）；氢氧化钠（分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20070301）；羧甲基纤维素钠（CMC，安徽山河药用辅料有限公司，批号：080503）；卡波姆（北京国人逸康科技有限公式，批号：20080120）；聚乙二醇－6000（辽阳华兴药用辅料厂，批号：20080105005）；d－葡萄糖（北京化工厂，批号：750516）。

1.4 仪器及耗材

KS225A 电子分析天平（Swiss made）；76－1恒温玻璃水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；

KQ－500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；101－3－S－II型恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；光学显微镜（LEICA BME）；LXJIIB型大容量低速离心机（飞鸽）；SHZ－D（III）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；ZHWY－103B型恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；681型磁力加热搅拌器（中国上海南汇电讯器材厂制）；MM－2270MG型微波炉（青岛海尔微波制品有限公司）。

1.5 实验前预处理

1.5.1 清洁与消毒

使用前先移出动物房内所有可移动设备与装置，然后彻底清洗，动物房干燥后，用汽油喷灯火焰消毒鸡笼和墙壁、地面上的鸡毛与粪便残渣。

地面、地面以上2米的墙壁及其它所有突出墙外的附属设施进行氨水喷雾消毒，然后密闭门窗，进行熏蒸消毒（每立方米鸡舍需用甲醛24mL、高锰酸钾12g、水24mL）24～48h，用前通风24～48h待用。

1.5.2 电线、塑料布、水槽、料槽

－20℃反复冻融3次（冻时将其放入塑料袋中不封口，将上述物品完全冻硬后取出。融时系住塑料袋口，放于室温即可）达到无球虫条件。

2 试验方法

2.1 复方妥曲珠利缓释微囊药效试验

2.1.1 实验分组

选择12日龄健康小雏鸡，逐只编号并空腹称重，淘汰体重过小及过大雏鸡，根据体重离散度随机分为6组（设感染不给药对照组T0和不感染不给药对照组C0），每组15只，其中每大组平均分为3个小平行组。T0～T4组分组后次日每只鸡人工感染柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）孢子化卵囊5.0×104个。感染用药T1～T4组于感染后72h通过饮水将药物按试验设计方法分别给药至试验结束，详见表1。

试验期间每天观察鸡群精神状态、采食、血便、发病和死亡情况，并对第6d的血便进行记分，同时收集第6、7d的粪便，用血球计数板法进行每克粪便卵囊记数（OPG）。感染后第8d称重，剖杀，观察盲肠病变并记分，记录攻毒前体重、剖杀前体重、死亡率、盲肠病变记分，计算体增重、相对增重率和抗球虫指数（ACI）。对于试验过程中死亡的鸡及时剖检，判定是否死于球虫病。

表1 试验分组Table 1 Test Groups

2.1.2 试验考察指标［7～9］

2.1.2.1 血便记分

在试验感染中，血便情况可用于对球虫感染程度的判断。自感染卵囊后每日观察各组鸡粪便情况，及时记录血便出现时间和血便最严重时的血便百分率，进行血便记分：

0分，100%的粪便不带血；1分，不足25%的粪便带血；2分，25%～50%的粪便带血；3分，51%～75%的粪便带血；4分，76%～100%的粪便带血。

2.1.2.2 存活率及增重情况

存活率／%＝组内存活鸡数／组内总鸡数×100

平均增重＝（末重－初重）／鸡数

增重率／%＝（末重－初重）／初重

相对增重率／%＝感染组鸡平均增重／健康对照组鸡平均增重×100。

2.1.2.3 OPG

OPG是指1g粪便中卵囊数。称取1g鸡粪，溶于10mL自来水中制成10倍的稀释液，充分搅拌均匀后，取1滴置血球记数板中，在显微镜下计算记数室四角4个大方格中球虫卵囊总数，除以4求其平均数，乘104即为 OPG［8］。

当OPG为0～0.1时卵囊值为0；当OPG为0.11～1.0时卵囊值为1；当 OPG为1.1～1.9时卵囊值为10；当OPG为2.0～5.9时卵囊值为20；当OPG值为6.0～10.9时卵囊值为30；当OPG大于11.0时卵囊值为40。

2.1.2.4 盲肠病变记分

在试验感染中，盲肠病变记分和粪便记分同样可用于对球虫感染程度的判断。按Johnson和Reid等的5分制记分。病变按有无轻重分为0、1、2、3、4五个等级。

0：未见病变；1：盲肠壁有极少量散在出血斑，肠壁不增厚，内容物正常；2：盲肠内容物有少量血液，肠壁稍增厚，可见多处出血斑；3：盲肠内容物有多量血液或有盲肠芯，肠壁肥厚，盲肠萎缩，内容物少；4：盲肠因充满血液或盲肠芯而肿大，盲肠壁极度肥厚，病变达直肠部（若两侧病变不一致，以病变严重的一侧为准）。因球虫病死亡鸡只记4分。

病变值＝每组鸡的平均病变记分×10

2.1.2.5 抗球虫指数（ACI）

ACI按默克公司（Merck）的方法计算

ACI＝（相对增重率＋存活率）×100－（病变值＋卵囊值）。

ACI＜120为无效，ACI＝120～160为中等有效，ACI＝160～180为药效良好，ACI＞180为高效。

2.2 数据处理方法

用SPSS 16.0统计软件对试验结果中数据进行ANOVA方差分析，分析组间数据的差异显著性。

3 试验结果

3.1 试验鸡的临床症状

T0～T4组雏鸡经口感染球虫后第三天，精神沉郁，羽毛蓬乱，缩头闭目，病鸡呆立于鸡舍一角，呈昏睡状态，反应迟钝，食欲减退，粪便变稀。T1～T4组开始给予相应药物。第四天末开始，T0～T4组雏鸡均排泄鲜血便，其中T0组血便严重，且陆续出现鸡只死亡，分别于17日龄、18日龄各死亡3只；T1～T4组血便较少，雏鸡均无死亡。详见表2。

表2 雏鸡攻毒后临床表现Table 2 Clinical Manifestation after Chicks Challenge

剖检死亡鸡只见到鸡冠与肉髯苍白，盲肠肿大如拇指大小，内有液状或部分凝固的血液，黏膜面有大量出血点及出血斑，从浆膜面看非常明显，外观为暗红色瘀点，其它组织器官无肉眼可见病变。

3.2 不同给药次数对鸡球虫病治疗效果的影响

T4、T1、T2和T3组的ACI依次增高，且均极显著（P＜0.01）高于感染不给药T0组，范围为178.98～188.14，均达到良好抗球虫效果；其中T2、T3组ACI＞180，达到高效抗球虫作用。T1～T4组在试验末体重均有升高，相对增重率范围为86.64%～92.36%之间，均比不感染对照C0组低，均极显著（P＜0.01）高于T0组，其中T1～T3组组间差异不显著；OPG均极显著（P＜0.01）低于T0组，但各组之间差异不显著（P＞0.05）；病变值均极显著（P＜0.01）低于T0组，其中T1～T3组，病变值随药物首次给药剂量增加而降低，详见表3、图1。

综合上述结果，以ACI为考察重点，相对增重率和病变值为次要考察点，可以确定ACI最高、病变值最低且相对增重率适中的试验3组的首次给药剂量和给药频率确定为复方妥曲珠利缓释微囊的最佳给药方案。

表3 各项指标结果Table 3 Results the Indicators

图1 各组相对增重率Fig.1 Relative weight gain rate of groups

4 分析与讨论

4.1 复方妥曲珠利药物作用机理

复方妥曲珠利药物成分中，妥曲珠利是广谱抗球虫药，高效低毒，可使球虫细胞的所有发育阶段都受到伤害，具有干扰核的分裂及线粒体的作用。磺胺类药物主要抑制球虫的生长繁殖，并无直接的杀虫作用，作用机理是与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，阻止二氢叶酸合成，最终影响蛋白质的合成，实现抑制球虫的目的。磺胺药作用于球虫的第二代裂殖体，即球虫生活史的第四天，甲氧苄啶也作用于球虫无性繁殖的后期。钙通道阻断剂硝苯地平可以在柔嫩艾美耳球虫病发生的早期阻断球虫的侵入，通过阻滞细胞膜上的钙离子通道，抑制细胞外钙离子内流，减少细胞内Ca2＋浓度，缓解宿主细胞的钙超载［10～12］。Ve本身并没有显著的抗球虫作用，但能增强机体的免疫功能，提高机体对各种应激的耐受力，促进病鸡的康复，提高存活率和相对增重，从而显著增强了鸡对球虫的抗性［13］。Ve是膜脂质双层中主要的抗氧化剂，是重要的氧自由基清除剂，可明显降低血清脂质过氧化物（包括 MDA）的浓度，具有中和清除能力［14］，对内皮细胞有保护作用。

治疗时必须使用足够的剂量和连续用药才能有效，否则球虫易产生抗药性，并将这种耐药性遗传好几代。如能合理配伍，本药不但能够抑制球虫耐药性，而且对混合细菌感染也有疗效。

4.2 缓释微囊的给药方案

缓释制剂以疗效长［7］为其特点，复方妥曲珠利缓释微囊是用天然粘附材料明胶制备的微囊，可与黏膜紧密接触粘附在一起。雏鸡的肠道粘膜是与肠内容物直接接触的部位，是肠道发挥消化吸收功能的界面，缓释微囊经口服混于食糜中达到肠道，明胶利用其生物粘附特性定位于肠道（盲肠），使药物缓慢释放，保持平稳、长期而有效的治疗浓度。

首次剂量过低时，药效释放缓慢，药量不能达到其最低有效剂量，此时雏鸡感染球虫已有3天，虫体大量繁殖，反复多次侵入盲肠上皮细胞，可使肠上皮细胞受到严重的破坏，影响肠黏膜的完整性，肠粘膜失去屏障作用，引起消化机能紊乱，营养物质吸收不良，饲料转化率降低，药物就不能起到很好效果。随着首次剂量的增加，其中各成分剂量接近或超出各自最低有效剂量，从而在柔嫩艾美耳球虫病发生的早期阻断球虫的侵入，通过阻滞细胞膜上的钙离子通道，抑制细胞外钙离子内流，减少细胞内Ca2＋浓度，缓解宿主细胞的钙超载，并提高机体对各种应激的耐受力，促进病鸡抗损伤作用，达到疗效。

给药频率与药物的半衰期紧密相关［15］，给药频率高，不超出药物半衰期，药物生效后一直处于最佳作用期间，可以保证疗效；给药频率低，超出药物半衰期，药效就会有所波动，呈现波峰波谷现象，疗效欠佳。

5 结论

在鸡感染柔嫩艾美耳球虫后第三天（粪便变稀）开始给药，于饮水中添加复方妥曲珠利缓释微囊，期间分别以不同频率给予每组鸡药物，各组鸡给药总量相同，试验表明：

（1）4d·次－1、1d·次－1、2d·次－1、3d·次－1用药组的抗球虫指数依次增高，其中，4d·次－1和1d·次－1用药组只达到良好抗球虫效果，2d·次－1和3d·次－1用药组均可达高效抗球虫作用。

（2）1d·次－1、4d·次－1、2d·次－1和3d·次－1用药组的病变值依次降低，3d·次－1用药组仅为2.67。

（3）发病后2次给药，首次剂量加倍组抗球虫指数可达188.14，高于其它给药组的 ACI（179.03、182.50、175.98），相对增重率达到90.80%，治疗效果显著，可作为的最佳推荐给药方案。

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