小牛血去蛋白凝胶对大鼠深II度烧伤创面愈合作用的实验研究

王金华 宋秋苓 宋光耀

小牛血去蛋白提取物(Deproteined Extract of Calf Blood，DECB)是一种幼牛静脉血去蛋白质后所得的小分子混合物，其主要作用为改善细胞能量代谢［1］。小牛血去蛋白凝胶是DECB系列的外用制剂，它是DECB加适宜基质配制而成，主要用于皮肤烧烫伤、溃疡等治疗，但其作用机理仍不十分清楚。本实验通过建立大鼠的深II度烧伤模型，以基质凝胶作对照，探讨小牛血去蛋白凝胶对大鼠烧伤创面愈合的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 体重200～250 g的斯普拉-道来(氏)(Sprague-Dawley，SD)大鼠，由辽宁医学院动物中心提供；小牛血去蛋白凝胶、基质凝胶(卡波姆)购自辽宁省锦州奥鸿药业有限公司，羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物模型制备、分组及处理 SD大鼠，腹腔内注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg，脱毛；次日同方法麻醉后，背部于80℃热水里烫15s，制成面积约为10%深II度烧伤模型。烧伤后的大鼠单笼饲养并随机分为A、B、C三组，每组20只。A组为自然愈合组，B组为基质凝胶组，创面外用基质凝胶，厚度为2～3 mm，每日换药一次，C组为小牛血去蛋白凝胶组，用法同 B 组。各组随机取 10 只大鼠于烫伤后 1、3、5、7、10、14、21 d活取创面组织标本，余下10只用做大体观察。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 HOP含量测定 应用化学比色法，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 成纤维细胞平均密度计数和毛细血管截面面数密度创面组织，10%的甲醛固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，切片HE染色。随机选取5个高倍视野(HPF)对毛细血管、成纤维细胞进行定量分析。

2 结果

2.1 烧伤创面HOP含量的变化 实验结果显示，创面HOP含量随着修复时间的延长而逐渐升高，在第14天达到峰值，随后又逐渐降低。A、B两组创面HOP含量在伤后不同时间的差异无显著性；伤后7、10、14 d，C组创面HOP含量显著高于B组(P＜0.01)；在其他时间，各组创面HOP的含量比较差异无显著性(P＞0.05)。(见表1)

表1 烧伤后各组创面的HOP含量随时间变化情况(±s，n=10，μg/mg蛋白)

表1 烧伤后各组创面的HOP含量随时间变化情况(±s，n=10，μg/mg蛋白)

注：与A组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；与B组相比，▲P＜0.05，▲▲ P＜0.01

images/BZ_228_237_2321_2245_2420.pngA组 1.43±0.39 1.49±0.47 1.72±0.25 2.01±0.22 2.28±0.27 2.71±0.24 2.53±0.41 B组 1.28±0.43 1.51±0.35 1.87±0.22 2.12±0.29 2.15±0.26 2.82±0.35 2.60±0.38 C组 1.23±0.56 1.58±0.24 2.05±0.46 2.78±0.34★★▲▲ 3.04±0.31★★▲▲ 3.76±0.43★★▲▲2.81±0.23

表2 伤后不同时间创面成纤维细胞平均密度计数(±s，n=50，个/HPF)

表2 伤后不同时间创面成纤维细胞平均密度计数(±s，n=50，个/HPF)

注：与 A 组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；与 B组相比，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

images/BZ_228_237_2740_1199_2839.pngA组29.81±3.2 56.57±4.3 83.48±4.8 B组 31.25±4.6 55.82±3.7 86.79±3.4 C组 46.38±4.1★★▲▲ 108.64±5.2★★▲▲ 118.93±4.2★★▲▲

2.2 成纤维细胞平均密度计数 伤后7、14、21 d，三组的成纤维细胞均呈增加趋势。B组略高于A组，但差异无显著性；C组明显高于B组(P＜0.01)。(见表2)

表3 伤后不同时间创面毛细血管截面数密度比较(±s，n=50，个/HPF)

表3 伤后不同时间创面毛细血管截面数密度比较(±s，n=50，个/HPF)

注：与A组相比，★P＜0.05，★★P＜0.01；与 B组相比，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01

images/BZ_228_1279_2854_2244_2953.pngA组5.34±2.7 38.24±3.1 58.94±3.6 B组 6.02±2.3 40.37±3.5 57.63±4.2 C组 15.26±3.4★★▲▲ 67.42±2.9★★▲▲ 85.82±4.7★★▲▲

2.3 毛细血管截面面数比较 伤后，随着时间的延长，毛细血管呈增加趋势。伤后7、14、21 d，C组毛细血管数量明显多于A、B组(P＜0.01)。B组毛细血管数量高于A组，但差异无显著性(P＞0.05)。(见表3)

3 讨论

烧伤创面愈合是一复杂的生物学过程，包括局部凝血、炎症反应、细胞增殖和细胞外基质的合成与重塑。其中，细胞增殖在创面愈合过程中的作用最为重要，其速度直接影响愈合时间和愈后质量。深Ⅱ度烧伤创面的细胞增殖主要包括成纤维细胞增殖和血管内皮细胞增殖，二者在创面愈合的过程中相互作用，相互影响。一方面，成纤维细胞产生的胶原蛋白可通过影响内皮细胞的形态，影响毛细血管生成；另一方面，新生毛细血管的数量增加，可以为成纤维细胞的代谢提供能量，加快胶原蛋白的产生。此外，胶原蛋白作为创面基质的主要成份，可为表皮细胞的迁移和增殖提供支架。HOP在胶原中所占比例恒定(大约12.5%)［2］，检测HOP含量可间接反映创面胶原的含量。本实验结果：在伤后7、10、14 d，小牛血去蛋白凝胶组创面HOP含量、成纤维细胞和毛细血管数量均明显高于自然愈合组、基质凝胶组，提示小牛血去蛋白凝胶具有促进烧伤组织中胶原合成、血管形成及成纤维细胞增殖作用。

小牛血去蛋白凝胶有明显促进烧伤创面愈合作用，其机制可能与小牛血去蛋白提取物能够促进缺氧细胞对氧和葡萄糖的摄取与利用，改善能量代谢有关［3-4］。在烧伤早期，小牛血去蛋白提取物能够改善局部组织细胞对氧的利用，促进葡萄糖的转运和代谢，使细胞的能量代谢趋于理想状态，从而为体内一系列再生反应提供所必须的能量物质，在根本上改变创面及损伤组织由于微循环中断而引起的缺氧和供给不足的状态。在创面愈合的细胞增殖期，小牛血去蛋白提取物能激发毛细血管形成，促进成纤维细胞的游走和增殖，从而使胶原的合成和积累增加，加速创面上皮化。此外，小牛血去蛋白提取物还能使胶原纤维重组，减少或避免瘢痕的形成。研究表明，小牛血去蛋白提取物可通过增加线粒体的呼吸能力和高能磷酸的合成，促进细胞对氧的利用。而小牛血去蛋白提取物促进细胞对葡萄糖的摄取作用可能与其有效成分之一磷酸肌醇寡糖(IPOs)有关，IPOs能激活细胞膜上的葡萄糖载体(GluT)，进而促进葡萄糖向细胞内的转运。IPOs除了激活GluT外，还能直接影响与糖代谢途径中一些酶的活性，如激活丙酮酸脱氢酶，环腺苷酸磷酸二酯酶和腺苷酸环化酶，从而促进葡萄糖的代谢［5］。

本研究结果提示，小牛血去蛋白凝胶可以通过促进创面血管内皮细胞、成纤维细胞增殖及胶原合成，加速烧伤的愈合，为临床烧烫伤用药提供参考。

［1］ Buchmayer F，P；einer J，Elmlinger MW，et al．Actovegin?：a biological drug for more than 5 decades．Wien Med Wochenschr，2011，161(3-4)：80-88.

［2］ Dimicco MA，Waters SN，Akeson WH，et al．Integrative urticular cartilage repair：dependence on developmental stage and collagen metabolism．Osteoarthritis and Cartilage，2002，10：218-225.

［3］ Pavlov OO．Effect of actovegin on dynamics of the oxygen methabolism in tissues．Klin Khir，2009，(1)：32-34.

［4］ 周丽敏，于佳胡，林富林等．小牛血去蛋白提取物对小鼠能量代谢的影响．东南国防医药，2010，12(2)：104-106.

［5］ Ziegler D，Movsesyan L，Mankovsky B，et al．Treatment of symptomatic polyneuropathy with actovegin in type 2 diabetic patients．Diabetes Care，2009，32(8)：1479-1484.