TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表达及意义

王文秀，马 超，杜文才

(天津市西青医院呼吸科，天津 300380)

TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表达及意义

王文秀，马 超，杜文才

(天津市西青医院呼吸科，天津 300380)

目的 观察TNF-α在COPD患者血清中的表达水平，并探讨其与COPD发生发展的关系。方法 实时荧光相对定量PCR(RQ-PCR)方法检测40例COPD患者组及40例正常对照组血清中TNF-α mRNA表达水平，通过SPSS15.0软件进行配对t检验。结果 采用2-ΔΔCt方法计算出正常组TNF-α mRNA表达比值为2.39，COPD组TNF-α mRNA表达比值为4.01。COPD病变组中TNF-α mRNA的表达量显著高于正常对照组，P＜0.05。结论 TNF-α参与COPD的病理过程。

TNF-α;COPD;炎症;细胞因子;逆转录聚合酶链反应

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统的常见病和多发病，是一种长期、慢性、反复发作且逐渐加重的疾病，给社会和患者家庭带来沉重的经济负担。随着对COPD研究的深入，其发病机制复杂，主要病理特征为气道慢性炎症［1-2］。气道慢性炎症的发病机制是IL-8、GM-CSF及ICAM-1等蛋白因子介导中性粒细胞在肺气道组织粘附、跨血管内皮转移、趋化等过程最终引起慢性炎症［3-4］。研究证实TNF-α能诱导成纤维细胞释放IL-6、IL-8、前列腺素E2(PGE2)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF);刺激巨噬细胞产生 IL -1β、IL -17［5-6］;并且增强细胞内ICAM-1的表达［7］。本研究主要采用实时荧光相对定量 PCR(RQ-PCR)，从基因水平观察TNF-α在COPD中的表达情况，并探讨其在COPD发生发展中的意义。

1 材料和方法

1.1 标本来源

根据2007年中华医学会制定的慢性阻塞性肺疾病(COPD)诊治规范诊断标准［8］，收集2011年6月—12月在天津市西青医院门诊就诊和住院治疗的COPD患者40例，30例男性和10例女性患者，年龄51～77岁，平均年龄(61±10)岁，平均病程(8±7)年。另外选择40例来自天津市西青医院的健康体检者作为正常对照组，其中男19例，女21例，平均年龄(59±10)岁。排除标准:合并有严重心、脑、肝、肾疾病或合并肿瘤者，患有免疫系统疾病者，近期使用过激素等影响免疫系统药物者。

所有研究对象均于晨起空腹采集肘静脉血4 mL，将血注入加有100 g/L的依地酸二钠钙(EDTA)50 μL和抑肽酶800 U的试管中混匀抗凝离心15 min，取上清置于-80℃冰箱保存待检。

1.2 实时荧光相对定量PCR(RQ-PCR)

1.2.1 总RNA的抽提:取血清标本约1 mL，加入1 mL TRIzol(美国Invitrogen公司)吹打匀浆，按照试剂盒说明书操作，收集组织总 RNA溶于20 μL DEPC处理水，-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 cDNA的合成和荧光定量PCR检测TNF-α mRNA的表达:采用ReverTra Ace Qpcr RT kit试剂盒(日本 TOYOBO公司)，按照试剂盒说明书将mRNA反转录成cDNA，所得cDNA保存于-20℃ 冰箱备用。取5 μL反应产物做模板，用特异性引物进行PCR反应。所有引物均由上海生工生物技术公司合成。引物序列见表1。

表1 引物表Tab 1 Primer table

使用 SYBR Green Real-timePCR MAster MiX试剂盒(TOYOBO公司)，按照试剂盒说明书配成50 μL反应体系，每个样本做个复孔，同时设不加模板cDNA的阴性对照。在 ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)上进行基因扩增:50℃2 min，95℃10 min，循环40次。结果采用2-ΔΔCt的方法分析 TNF-α mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。每个标本平行重复检测PCR 3次取均值，采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RNA的纯度和浓度鉴定

用1.2%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测抽提RNA的纯度和浓度，电泳显示RNA标本28S、18S和5S 3条带清晰，28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍，说明抽提的 RNA纯度较好;选取260 nm和280 nm吸光度值(A)比值(A260/A280)为1.8～2.2的标本为合格标本进行下一步实验。

2.2 TNF-α RQ-PCR扩增产物电泳

收集PCR扩增产物，取10 μL在1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液中电泳检测PCR扩增产物，结果如图1所示。电泳结果显示，PCR扩增产物呈单一亮带，片段大小为307 bp，扩增特异性良好。

2.3 TNF-α mRNA在COPD病变组和正常对照组中的表达水平

图1 TNF-α RQ-PCR扩增产物电泳Fig 1 TNF- α RQ-PCR amplification product electrophoresis

所有标本均重复检测3次取均值，反应完成后读取阈值(Ct)。采用 2-ΔΔCt方法计算出正常组TNF-α mRNA表达比值为2.39，COPD组 TNF-α mRNA表达比值为4.01。结果显示COPD病变组中TNF-αmRNA的表达量均显著高于正常对照组(P ＜0.05)。

3 讨 论

COPD是一种以进行性气流受限为特征的慢性肺通气功能障碍性疾病，其致病原因和发病机制非常复杂，可以逐渐形成肺动脉高压，并最终导致肺源性心脏病［9-10］。研究证实COPD的主要病理特征是气道、肺实质以及肺血管的慢性炎症［11］。其气道慢性炎症是通过肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等免疫细胞产生的多种细胞因子介导的结果［12-13］。研究发现白细胞介素 -8、白细胞介素 -6、TNF-α以及IFN-γ在内的细胞因子是构成COPD气道慢性炎症的复杂的炎症细胞网络的重要组成部分，它们之间互相促进，促使局部炎症发生、发展，最终导致气道的重塑和气道的阻塞［14］。作为重要的促炎症因子，TNF-α在自身免疫和慢性炎症性疾病中发挥着重要的作用［15］。TNF-α可以增加成纤维母细胞黏附分子(ICAM-1)的表达;刺激上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生 IL-6、IL-8、基质金属蛋白酶(MMPs)和PGE2;诱导单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的产生，从而促进中性粒细胞和单核细胞的募集和活化，促进炎症反应［16-17］。

本实验采用实时荧光相对定量PCR技术，检测了40个COPD患者血清中TNF-α的含量，从基因水平探讨了TNF-α在COPD中的表达变化。实验结果表明COPD病变组TNF-α mRNA的相对表达量显著高于对照组，说明 TNF-α的表达与COPD相关，TNF-α可能参与COPD病变的病理过程。

本研究结果显示COPD患者体内TNF-α的表达及其介导的炎症反应与COPD病变的发生发展存在一定相关性。但是TNF-α在COPD慢性炎症过程中究竟起到什么作用仍需要进一步研究探索。

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Expression of TNF-α in patients with chronic obstructive pulmonary disease

WANG Wen-xiu，MA Chao，DU Wen-cai
(Department of Respiration，Tianjin Xiqing Hospital，Tianjin300380，China)

［Abstract］ObjectiveTo study the expression of TNF - αin patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)，and the relationship between TNF-αexpression and COPD.MethodsThe TNF-α mRNA levels in serums of COPD patients(40 cases)and control group(40 cases)were analyzed by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RQ - PCR).ResultsThe expression ratio of control group was 2.39 and COPD group was 4.01.The data were analyzed by t testP＜0.05.ConclusionThe study suggests that involvement of TNF-α in the pathomechanism of COPD.

［Key words］TNF - α;COPD;inflammation;cytokines;reverse transcriptase polymerase chain reaction

R563.1

A

1671-7295(2013)02-0143-03

王文秀，马超，杜文才.TNF-α在慢性阻塞性肺疾病中的表达及意义［J］.大连医科大学学报，2013，35(2):143-145.

10.11724/jdmu.2013.02.11

王文秀(1982-)，女，山东东营人，住院医师，硕士。E-mail:wwx_2001@163.com

杜文才，教授。E-mail:duwencai@126.com

2012-12-20;

2013-03-06)