甲醛对大蒜根尖分生组织的毒性效应

李 亚 琳

(1．渭南师范学院 化学与生命科学学院，陕西 渭南714000;2．陕西省多河流湿地生态环境重点实验室，陕西渭南714000)

甲醛(Formaldehyde)是重要的化学药剂和致癌物质．近几年，由于建筑结构的变化以及新型装修材料的使用，导致室内空气中有害物质不断上升，而甲醛是室内空气污染的主要来源之一．早在2004年，国际癌症研究机构已经把甲醛列为第一类致癌物质［1－3］，而对室内环境污染的监测主要运用理化方法．利用植物检测环境污染更为简便、经济，其结果与动物实验也具有高度的一致性，因此国际上广泛运用植物监测系统对环境化学物质进行检测［4－5］．植物净化甲醛的报道也很多，但主要是对吸收甲醛的植物种类的筛选、植物吸收甲醛的机理研究以及外界环境因子(温度、湿度、光照)对植物吸收甲醛的影响［6－8］．这些方法设备昂贵、灵敏度低，而且受影响因素也多，不能正确反映毒性物质实际的生物效应，所以也不能正确评估污染物的实际毒效应和多种污染物的综合效应．

大蒜(Allium sativum L，Liliaceae)属百合科葱属植物，易于在室内培养，是一种无毒害的、廉价易得的植物．其根尖生长迅速，很容易观察细胞的有丝分裂．本实验用不同浓度的甲醛溶液处理大蒜根尖，观察甲醛对根尖细胞有丝分裂的影响、微核的产生以及染色体畸变，分析大蒜对甲醛的毒性效应，探讨大蒜作为甲醛污染指示植物的可行性．

1 实验仪器和方法

1．1 实验材料

1．1．1 材料与仪器

大蒜(2n=16)，百合科植物，购于农贸市场;培养皿、量筒、容量瓶、恒温箱、移液管、胶头滴管、水浴箱、培养皿、冰箱、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜．

1．1．2 试剂

(1)甲醛溶液;

(2)卡诺固定液:(甲醇∶冰醋酸=3∶1);

(3)1 mol/L盐酸;

(4)改良苯酚品红染色液:

原液A:取3 g碱性品红溶于100 mL 70%酒精中，此液可以长期保存．

原液B:取A液1 mL加入9 mL 5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周内使用)．

原液C:取B液5．5 mL加入0．6 mL的冰醋酸和0．6 mL 38%的甲醛(可长期保存)．

染色液:取C液1～2 mL，加入8～9 mL 45%醋酸和0．15 g山梨醇．放置2周后使用，染色效果显著，可普遍用于植物组织的压片法和涂片法．山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用．

1．2 实验方法

1．2．1 分组

设3个处理组和一个对照组，处理组甲醛浓度分别为0．1%、0．3%和0．5%，对照组用蒸馏水代替．处理时间为24 h、48 h、72 h 和 96 h．

1．2．2 材料培养

将一颗完整无损的大蒜(除去老根)去外皮放在培养皿中用蒸馏水培养，并放在25℃的恒温箱中，每天按时换水两次．当大蒜根长至1 cm时，选取根长一致、大小均匀的蒜瓣分成4组，转移到盛有不同浓度甲醛溶液的培养皿中，分别染毒24 h、48 h、72 h和96 h，对照组直接用蒸馏水培养．

1．2．3 过程

(1)固定:剪取根尖1～2 cm长，用蒸馏水冲洗，然后放入卡诺固定液中固定24 h．

(2)保存:用蒸馏水冲洗固定过的大蒜根尖4次，放入70%乙醇中，置于冰箱4℃保存，以供细胞分裂行为观察．

(3)解离:用1 mol/L的盐酸60℃水浴软化大蒜根尖8～10 min左右，用蒸馏水多次冲洗．

(4)切片制作:将以上处理的根尖置于洁净的载玻片上，用刀片将根冠和伸长区切除，只留乳白色的分生区．用眼科镊子轻轻将根尖分生区捣碎，滴加一滴改良苯酚品红染液，染色5～10 min后，盖上盖玻片，轻压盖玻片，把材料压成均匀的薄层，用吸水纸吸干盖玻片周围染液，制成临时切片．

(5)镜检:常规压片，在40×10倍显微镜下观察，统计大蒜根尖有丝分裂的细胞数目，计算其有丝分裂指数(有丝分裂指数=细胞分裂个数/细胞总数)．每个处理观察3个根尖，每个根尖观察300个细胞，统计分裂指数(MI)．

1．3 微核及染色体畸变的观察

用奥特显微镜对细胞形态进行观察并拍照，观察微核的产生及染色体畸变情况．

1．4 统计学分析

表1中的数值代表3次独立试验的平均值(means±S)，结果用方差分析及t检验．

2 结果与分析

2．1 甲醛对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响

有丝分裂指数是判断细胞毒性效应的重要参考指标．由表1可见，不同浓度的甲醛溶液处理后，大蒜根尖细胞的分裂指数均明显降低，与对照组比较具有显著性差异(p＜0．05)．随着甲醛浓度的升高，有丝分裂指数也逐渐降低(p＜0．05)．

表1 甲醛溶液对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响

由表1可以看到，随着处理时间的延长，有丝分裂指数有减小的趋势．与对照组相比，不同时间处理组与对照组均有显著性差异(p＜0．05)，说明处理时间越长，甲醛对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响也越大．

2．2 甲醛对大蒜根尖细胞形态的影响

由图1可见，对照组根尖细胞有丝分裂数目较多，细胞形态规则，排列整齐，见图1(A)．甲醛侵染大蒜后，随着甲醛浓度的增加，明显观察到大蒜根尖细胞有丝分裂的数目减少．而且染色体的形态变化也很明显，在低浓度处理下，很多细胞核里的染色体团聚在一起，染色较深，细胞不能正常分裂，见图1(B)．随着甲醛浓度的增加，细胞核里的染色体逐渐分解，因而细胞核染色变浅，有的细胞逐渐解体，见图1(C、D)．A

图1 不同浓度的甲醛溶液对大蒜根尖细胞形态的影响

2．3 甲醛对大蒜根尖细胞染色体畸变的影响

观察发现不同浓度的甲醛溶液处理后，大蒜根尖细胞都不同程度地产生了微核(图1)．而且甲醛浓度越大，微核产生得越多．

2．4 甲醛处理对大蒜根尖和茎尖生长的影响

实验测量分析了甲醛处理不同时间后大蒜根尖和茎尖的生长情况．结果显示，不同浓度的甲醛溶液处理后，均明显抑制大蒜的根尖和茎尖生长．与对照相比较，不同浓度甲醛处理96 h后，茎的平均生长量分别为85．6%、74．25% 和 67．8%;根的平均生长量分别为 61．94%、59．68% 和 57．1%，差异极其显著(p＜0．05)，统计结果见表2．从表2还可以看出，甲醛对大蒜根生长的抑制作用更明显．

3 讨论

植物根尖有丝分裂指数可以作为监测环境中甲醛含量的参考指标．本实验中，大蒜根尖细胞有丝分裂指数随着处理甲醛溶液浓度的增高以及处理时间的延长而降低．显而易见，甲醛浓度越大、处理时间越长，它在植物体内累积得就越多，其毒性越强，抑制作用也越明显．

实验观察到不同浓度的甲醛溶液都能引起染色体畸变，并且随着甲醛浓度的升高，畸变程度也越严重．甲醛阻碍细胞分裂，导致有丝分裂指数下降的原因，可能是因其抑制了有丝分裂相关蛋白的合成．若甲醛毒性导致染色体复制异常或染色体受损或纺锤丝的破坏，则在有丝分裂后期，两组染色体就不能正常分开，进而损伤的染色体发生融合而团聚在一起［9－10］，出现了凝聚．本实验也观察到，低浓度甲醛处理后，细胞核深染，说明染色体发生了凝聚．

表2 甲醛处理对大蒜根尖和茎尖生长的影响

微核(micronucleus)，也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式．微核的产生是由外界毒性物质作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成一个或数个小核．本研究发现不同浓度的甲醛均能引起染色体畸变．田秋元［11］和韦立秀［12］曾报道，蚕豆根尖细胞对大气中的甲醛非常敏感，当甲醛浓度为2．85 mg/m3时，蚕豆根尖细胞微核率就明显高于对照，达到极显著差异水平．随着甲醛处理时间的延长，蚕豆幼根细胞微核率明显升高，微核率与处理时间之间呈现明显的正相关关系．本实验中，不同浓度的甲醛处理均能刺激微核的产生，在分裂后期个别染色体有滞后现象，这些落后的染色体逐渐解体，形成大小不一的微核．

在正常生长情况下，大蒜根尖和茎尖以正常速度生长．但是甲醛是一种毒性很强的液体，甲醛处理会对大蒜根尖和茎尖生长起到抑制作用．这可能是由于甲醛溶液使根尖和茎尖细胞分裂分化受阻，生长点部分坏死．由于根尖细胞直接接触甲醛溶液，因此实验观察到甲醛处理对大蒜根尖生长的抑制作用明显大于对茎尖生长的影响．

甲醛对人类健康的危害人尽皆知，而甲醛对植物也产生很强的毒性效应．当植物体内积聚的甲醛数量超过植物自身的净化能力时，植物就会不同程度受伤，如萎焉、叶黄、生长缓慢甚至死亡等．本研究以染色体大而清晰、便于观察的大蒜根尖为材料，研究了不同浓度的甲醛溶液对大蒜根尖细胞有丝分裂以及根尖和茎尖生长的影响和微核的产生，明确了大蒜是对甲醛毒性比较敏感的植物种类之一，证明甲醛对大蒜根尖细胞有明显的毒性效应，其根尖细胞有丝分裂指数可作为监测环境甲醛含量的参考指标．

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