半胱天冬蛋白酶8基因多态性与先天性心脏病易感性的关联研究

聂 宇 刘 锐 顾海勇 何 锋 张 辉 刘瑞平 张 浩

1.中国医学科学院 北京协和医学院 国家心血管病中心 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室，北京 100037；2.南京医科大学附属常州市第二人民医院中心实验室，江苏常州 213003

在胚胎正常发育过程中，细胞凋亡对生长和发育的调控发挥了重要作用；凋亡异常是导致胚胎异常发育的重要因素之一[1]。半胱天冬蛋白酶8（Caspase8）是一种细胞凋亡半胱天冬蛋白酶前体；Caspase8基因敲除小鼠会导致心肌缺陷并在胚胎期死亡，提示该蛋白酶与心脏发育密切相关[2]。现已发现，编码人类半胱天冬蛋白酶的基因Caspase8存在功能性多态性位点rs3769818 C＞T，并与多类疾病的易感性相关[3]，但尚未有针对Caspase8 rs3769818 C＞T基因多态性与先心病易感性的相关研究。

先天性心脏病是新生儿致病和死亡的主要原因之一，在新生儿中的发病率约为1%[4-7]。多数先心病是遗传与环境交互作用的结果；目前，已经有大量研究人员开始关注不同遗传背景个体在先性心病易感性方面的差异，其中单核苷酸多态性（SNP）是个体遗传差异的一个重要因素。鉴于Caspase8在心脏发育过程中的关键作用，探索先心病患儿中Caspase8 rs3769818 C＞T携带情况，对于理解先心病发病机制有重要意义。本研究对大动脉转位（transpositionof the great arteries，TGA）和法洛四联征（tetralogy of Fallot，TOF）两类圆锥动脉干畸形先心病患儿，以及正常对照人群利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对Caspase8 rs3769818 C＞T基因型和等位基因差异进行了比较分析，进而探讨Caspase8基因与先天性心脏病发生的相关性。

表1 三组一般资料比较

1 资料与方法

1.1 一般资料

对照组136例，为2009年12月～2011年7月在镇江市第一人民医院和常州市第二人民医院的非先天性疾病患者。病例组244例（其中TOF组120例，TGA组124例），为同一时期在中国医学科学院阜外心血管病医院收集。所有对象均为汉族人群，病例组与对照组年龄、性别差异均统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究所涉内容已通过医院伦理委员会评审，在样本采集过程中所有研究对象均由法定监护人代理签署知情同意书，研究对象及其法定监护人对研究知情同意。TOF组平均年龄（1.55±0.70）岁，TGA组平均年龄（2.27±0.49）岁，对照组平均年龄（1.58±0.61）岁；TGA组中30.6%为女性，TOF组中38.3%为女性，对照组中38.2%为女性。统计分析结果显示年龄性别匹配较好。见表1。

1.2 实验方法

获取知情同意后，进行问卷调查调查相关背景资料。受试人群空腹采集2 mL（EDTA抗凝），1 h内4000 r/min离心10 min，分离白细胞。运用Qiagen DNA提取试剂盒提取白细胞DNA，进行分装低温冻存。运用美国Sequenom公司的MassARRAYTM Analyzer技术平台进行SNP分型，具体步骤见参考文献[8]。结果由MassARRAYRT软件系统实时读取，MassARRAY Typer 4.0软件完成基因分型分析。为验证检测的准确度，10%的样本接受重复检测。

1.3 统计学方法

统计学处理应用SPSS 13.0统计软件包完成。病例组与对照组的基本特征进行χ2检验和（或）t检验；采用单因素Logistic回归分析计算优势比（odds ratio，OR）及其95%置信区间（confidence interval，CI）（表示 Caspase8 rs3769818 C＞T多态性位点变异型与野生型纯合型比较，导致先心病发生的相对风险度）。

2 结果

2.1 遗传平衡检验

将对照人群Caspase8 rs3769818 C＞T位点的基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果提示P值符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律 （P=0.951）， 说明该人群Caspase8 rs3769818 C＞T位点基因型频率处于平衡状态，具有群体代表性。

2.2 SNP位点质谱分型

基于MALDI-TOF的质谱分型结果显示，对Caspase8 rs3769818 C＞T等位基因的分型结果良好可信，TOF组，TGA组和对照组CC基因型共193例，CT基因型共146例，TT基因型共36例，分型失败共5例，分型成功率达到98.68%（图1），能够用于进一步的相关性分析。

图1 Caspase8 rs3769818 C＞T多态性位点质谱（MALDI-TOF MS）分型图

2.3 Caspase8 rs3769818 C＞T位点基因型分布与先心病易感性关系

在单个位点的分析中，笔者发现TOF及TGA病例和对照中Caspase8 rs3769818 C＞T位点发生频率差异不明显。Logistic回归分析结果发现，与携带Caspase8 rs3769818 CC基因型的个体相比较，Caspase8 rs3769818 CT基因型携带者与先心病（TGA和TOF）的发病风险不存在明确相关性 （TOF OR=0.99，95%CI=0.59～1.67；P=0.974）和（TGA OR=0.99，95%CI=0.59～1.67；P=0.974）（表2）；携带Caspase8 rs3769818 TT基因型与TOF及TGA的发病风险无明显相关（TOF OR=1.17，95%CI=0.45～2.98；P=0.751）和（TGA OR=1.86，95%CI=0.79～4.41；P=0.157）（表2）。在显性模型和隐性模型中，Caspase8 rs3769818 C＞T各基因型与TOF及TGA的发病风险无明显相关（表2）。

表2 Caspase8 rs3769818 C＞T多态性和先天性心脏病危险关系的Logistic回归分析

3 讨论

Caspase8多态性与肿瘤等多种疾病易感性相关[9-12]，但对Caspase8多态性与先天性心脏病易感性的研究尚无报道。本文以两种圆锥动脉干畸形先心病（TGA和TOF）为对象，研究了Caspase8 rs3769818 C＞T多态性位点与中国人群先天性心脏病发生风险之间的相关性。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分型及统计学分析，本研究发现Caspase8 rs3769818 C＞T多态性与先天性心脏病TGA和TOF的发病危险性无明确关联。研究结果显示Caspase8 rs3769818 C＞T最小等位基因型频率（minor allele frequency，MAF）为0.274，该频率与Hapmap数据库中提供的亚洲人群相应位点的基因型分布无明显差异（T：0.300），同时对照基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P=0.951）；说明对照人群选择具有代表性。

需要指出的是，尽管本研究结果提示Caspase8 rs3769818 C＞T与先心病发生风险无明确相关性，但本研究样本量不大，并且是以医院为基础的病例对照研究，不能完全排除选择偏倚。另一方面，先心病的发生也可能与母亲基因型的关系更大，但本研究没有涉及母亲Caspase8 rs3769818 C＞T多态性与子代先心病易感性的关系，也缺乏凋亡相关其他基因以及基因-基因相互作用的研究。未来，我们需要在不同人群中进行大样本的研究再加以功能学验证方可能获得更为明确的答案。

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