UFLC法同时测定护肝胶囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素

张林林， 王永吉， 李 航， 张 辉， 孙佳明*

(1．长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117;2．长春中医药大学第一附属医院内儿科，吉林长春130021)

护肝胶囊由《中国药典》收载品种护肝片改制而来，制剂处方由柴胡、五味子等组成，具有疏肝理气，健脾消食，降低转氨酶的作用，用于慢性肝炎、迁延性肝炎及早期肝硬化等［1］。其五味子中所含木脂素类成分与其具有抗肝脏损伤、抗氧化的作用明显相关，故木脂素的量直接影响护肝胶囊的质量及临床应用［2-6］。

目前，多是针对护肝胶囊中柴胡皂苷-α或五味子醇甲或是护肝片中五味子甲素和乙素单个有效成分测定的报道，尚未有同时对护肝胶囊中3种有效成分质量控制方法的报道［1，7-15］。为了提升其质量控制标准，采用超快速液相色谱 (ultrafast liquid chromatography，UFLC)新分析技术对护肝胶囊中的五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素3种活性成分进行了同时测定。UFLC可实现高体积流量、高分辨率分析，适用于要求高通量、高效率的分析工作，在药物分析领域前景广阔［16-20］。本实验采用UFLC法同时测定护肝胶囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3个五味子木脂素的量，以多成分指标体系综合评价护肝胶囊的质量。

1 实验材料

1.1 实验仪器 UFLC-20AD超快速液相色谱仪、PAD检测器MB20A、LCsolution色谱工作站，日本岛津公司。BP211D型十万分之一电子天平 (德国Sartorius公司);电热恒温水浴锅 (江苏南通县通海电器厂)。

1.2 试剂与药品 五味子醇甲 (批号:110857-200608)、五味子甲素 (批号:110764-200107)、五味子乙素对照品 (批号:110765-200205)，均购自中国药品生物制品检定所，定量测定用。水为娃哈哈纯净水;除高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯，其余实验中所用化学试剂均为分析纯。护肝胶囊由吉林修正药业集团股份有限公司提供。阴性对照为本实验室自制。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent SB C18色谱柱 (100 mm×4.6 mm，1.8μm)，体积流量0.4 mL/min;柱温40℃;检测波长250 nm。进样量2μL。

表1 UFLC同时检测3种成分梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution requirement of simultaneous determ ination of three com ponents by UFLC

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲29.2μg、五味子甲素16.4μg、五味子乙素20.0μg的混合对照品溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取护肝胶囊内容物适量，混匀，研细，取约0.7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的乙酸乙酯25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过后，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方组成比例制备缺五味子阴性制剂，再按2.2.2项制备方法，制备五味子阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验 分别吸取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合对照品溶液、护肝胶囊供试品溶液及缺五味子的阴性对照品溶液各2μL，注入超高速液相色谱仪进行分析，结果表明阴性对照溶液在与五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合对照品峰相同的保留时间处无干扰峰出现，说明处方中其他药味对测定结果无影响，见图1。

图1 对照品 (A)、护肝胶囊供试品 (B)和阴性对照(C)UFLC色谱图Fig.1 UFLC chromatograms of m ixed reference substances(A)，Hugan Capsules sam ple(B)and negative sample w ithout Schisandrae chinensis Fructus(C)

2.4 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下的对照品溶液1、5、10、15、20μL，注入超高速液相色谱仪，记录峰面积。以质量浓度为横坐标 (X)，相应的色谱峰峰面积为纵坐标 (Y)，绘制标准曲线，结果见表2。

表2 3种有效成分的线性方程和线性范围Tab.2 Linear equations and linear ranges of three components

由表2可知五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素进样量分别在0.029 2～0.584μg/μL、0.016～0.328 μg/μL、0.02～0.40 μg/μL范围内有良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取2.2.1项下的对照品溶液，按2.1项色谱条件，重复进样5次，进样量为5 μL，测定峰面积值，计算五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的 RSD分别为0.90%、0.80%、0.80%(n=5)。试验表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取本品 (批号110901)10 mL，按2.2.2项下供试品制备方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件，分别于0、4、8、12、24 h进样1次，考察精密度五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD分别为0.60%、0.60%和0.50%(n=5)，结果供试品溶液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在24 h内峰面积无明显变化。

2.7 重复性试验 取护肝胶囊样品 (批号:110901)5份，按2.2.2项下方法制备样品供试液，按2.1项色谱条件进行定量测定，结果五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素平均质量分数分别为1.21 mg/g、0.36 mg/g和0.55 mg/g，RSD分别为2.40%、2.80%、2.50%(n=5)，表明此法重复性良好。

2.8 回收率试验 取同一批已测定的样品 (批号110901)适量5份，每份5 mL，分别准确加入对照品溶液五味子醇甲 (29.2μg/mL)14.5 mL，五味子甲素 (16.4μg/mL)8 mL，五味子乙素(20.0μg/mL)9.5 mL。按2.2.2项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按其2.1项色谱条件进行测定，计算回收率。五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素平均回收率 (n=5)分别为99.7%、98.5%、99.2%;RSD分别为 1.1%、2.3%、1.6%。试验结果表明加样回收率良好。

2.9 样品测定 取3批护肝胶囊 (批号分别为091103、110802、081101)，按2.1项色谱条件和测定方法，测定五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面积，根据多点外标法计算护肝胶囊品中的3种有效成分的含量，结果见表3。

表3 3批护肝胶囊样品的测定结果(n=3)Tab.3 Assay results of three batches of Hugan Capsules samp les(n=3)

根据国家食品药品监督管理局国家药品标准关于护肝胶囊定量测定的规定:本品每粒含五味子以五味子醇甲 (C24H32O7)计，不得少于0.28 mg;以五味子甲素 (C24H32O6)计，不得少于0.05 mg;以五味子乙素 (C23H28O6)计，不得少于0.15 mg。本实验采用UFLC同时测定护肝胶囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的量均符合规定。

3 讨论

3.1 护肝胶囊中五味子具有气阴双补，养肝护肝之效。其中五味子醇甲、甲素和乙素为主要有效成分，因此同时测定护肝胶囊中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3种主要成分，对更好地控制护肝胶囊的内在质量具有重要意义。

3.2 本实验采用UFLC新型液相色谱技术，所用亚微米级色谱柱填充了1.8μm粒度的填料，能获得更高的柱效，并能缩短分析时间，增加峰容量，降低柱外峰展宽效应。在流动相的选择上，曾采用《中国药典》中的流动相即甲醇-水 (63∶37)。但分离效果不是很好，故选用了乙腈-水为流动相进行梯度洗脱的方法，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均能与其它杂质峰分离良好。

3.3 本实验通过方法学研究，建立了UFLC法同时测定护肝胶囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3种主要成分。该方法精密度高、重现性好、操作简便，测定结果准确可靠，是一种高效、可行的质量评价技术。为护肝胶囊的质量控制提供了科学依据。

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