汽爆玉米秸秆糖化及发酵丁醇工艺的优化研究

刘利平，申利英，常 春

(郑州大学化工与能源学院，河南郑州450001)

0 引言

能源短缺与环境污染，使新型生物能源的开发势在必行.丁醇因其具有能量密度高、易与汽油混合等特点，而成为替代石油的重要选择［1］.秸秆是地球上最丰富廉价的资源，以秸秆为原料制备生物丁醇在解决粮食、能源、环境污染等问题中具有重要的作用.

微生物无法直接利用秸秆为底物进行丁醇发酵，需将其水解产生葡萄糖、木糖等单糖后再用于丁醇发酵［2］.而水解后还原糖含量直接影响到丁醇的产量.但目前，对经蒸汽爆破预处理的玉米秸秆为原料，进行糖化和丁醇发酵工艺研究的报道较少.李冬敏等［3］用汽爆玉米秸秆进行丁醇发酵，丁醇浓度达到了6.52 g/L.其丁醇含量较低，难以满足规模化应用的条件.因此，本研究尝试首先通过对汽爆玉米秸秆的糖化工艺进行考察，筛选出较佳的糖化工艺，并在此基础上，分别对温度、pH值、底物浓度、纤维素酶用量、菌种种龄及接种量、培养基的组成和发酵时间8个方面进行丁醇发酵工艺条件的试验研究，得出汽爆玉米秸秆发酵丁醇的优化工艺，为进一步的放大试验研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetbutylicum ZZU-01):郑州大学生化中心保藏;种子培养基:5%玉米醪;种子液活化:取一玉米醪储存的试管菌种，沸水浴中处理90 s.然后在厌氧操作台上(YQX-Ⅱ厌氧培养箱，上海跃进医疗器械厂)接种于5%玉米醪培养基，活化至对数期;纤维素酶:滤纸酶活力110 IU/mL;汽爆玉米秸秆:将玉米秸秆切至3～4 cm长，于1.5 MPa，205℃条件下汽爆处理8 min，汽爆处理后秸秆经水洗脱毒并于80℃干燥恒重后，保藏待用;酶解液的制备:取一定量烘干的秸秆于锥形瓶中，加自来水，使底物质量分数为15%.然后按照糖化工艺设计的条件加入纤维素酶(30 IU/g)，木聚糖酶(200 IU/g)，Tween-20(质量分数为0.15%)，调pH为4.8，于50℃，150 r/min下反应一定时间后，离心取上清液.

1.2 糖化工艺设计

以蒸汽爆破预处理的玉米秸秆为原料，共进行了6种不同的秸秆糖化发酵丁醇工艺研究(称为糖化工艺Ⅰ～Ⅵ).分别对比了汽爆玉米秸秆经6种糖化工艺后的丁醇发酵结果.不同糖化方法的具体工艺为

糖化工艺Ⅰ:将纤维素酶一次性加入，糖化48 h;

糖化工艺Ⅱ:首先加入纤维素酶量的1/2，反应24 h后再加入1/2纤维素酶，共糖化48 h;

糖化工艺Ⅲ:将纤维素酶分成3等份，首先加入纤维素酶量的1/3，每隔6 h加一次纤维素酶，共糖化24 h;

糖化工艺Ⅳ:纤维素酶加入法与糖化工艺Ⅲ相同，但糖化时间延至48 h;

糖化工艺Ⅴ:首先加入纤维素酶量的1/3，反应24 h后，再加入1/3纤维素酶，剩下的纤维素酶再隔12 h加入，共糖化48 h;

糖化工艺Ⅵ:初始底物体质量分数为15%，加入相应量的纤维素酶，反应24 h，每隔12 h，补一次原料，并且加入相应量的纤维素酶，共糖化48 h.

1.3 发酵培养基与培养方法

发酵培养基:秸秆酶解上清液1 L，酵母抽提物 1 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO45 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，尿素 2 g，CaCO35 g［3-4］.pH7.0，121 ℃，灭菌 20 min.除了考察培养基的影响因素外，其他试验中的发酵培养基均采用以上基础培养基.

发酵方法:将活化24 h的种子液，按体积分数为5%接种量进行接种，首先采用35℃，厌氧发酵72 h的条件，考察不同糖化工艺对丁醇发酵的影响.在此基础上，对丁醇发酵的温度、底物浓度、纤维素酶的用量、接种量和发酵时间进行了单因素试验;对培养基酵母抽提物，KH2PO4，MgSO4·7H2O，(NH4)2SO4，FeSO4·7H2O，尿素和CaCO3进行了L32(74)正交试验.在优化的基础上，对发酵后的丁醇产量进行了考察.

1.4 分析方法

(1)秸秆成分测定:采用质量减重法［5］.

测得汽爆玉米秸秆主要成分为:纤维素的质量分数为33.68%;半纤维素的质量分数为7.29%;木质素的质量分数为22.31%.

(2)还原糖的测定:DNS 法［6］.

(3)溶剂的测定:气相色谱法［7］.

2 试验结果与分析

2.1 糖化工艺对丁醇发酵的影响

根据1.2节的试验设计，以还原糖含量和发酵丁醇浓度为考察目标，试验结果如表1所示.

表1结果表明，糖化工艺Ⅵ的还原糖含量最高，为48.77 g/L，但丁醇含量仅有4.01 g/L，这可能是因为分批补料糖化使底物浓度增加的同时，也增加了抑制剂的浓度，严重抑制了丁醇发酵.糖化工艺Ⅰ与Ⅱ相比较，可知分步酶解要比一步酶解得到的还原糖含量高，还原糖含量的增加，也使得后续的丁醇发酵的浓度升高.以上结果表明，多步糖化和适当的糖化时间能够更充分地酶解纤维素，提高还原糖的含量，从而提高后续的丁醇发酵浓度.糖化工艺Ⅴ的丁醇产量达到了7.44 g/L，高于其它5种糖化发酵的丁醇产量，因此糖化工艺Ⅴ是汽爆玉米秸秆糖化发酵丁醇工艺中较优的工艺路线.下面在糖化工艺Ⅴ的基础上，进一步优化丁醇发酵的工艺条件.

表1 不同糖化发酵试验结果Tab.1 Fermentative results of different saccharification

2.2 丁醇发酵工艺条件的优化

2.2.1 温度对发酵的影响

本研究以得到最高的丁醇浓度为考察目标，首先对温度的影响进行考察.试验条件为:底物浓度15%(质量分数)，纤维素酶用量30 IU/g，接种量7%，基础培养基，发酵时间72 h.不同温度对丁醇发酵的影响如图1所示.由图可知，本试验中发酵温度为37℃时，丁醇产量最高.

图1 温度对发酵的影响Fig.1 Effect of temperature on fermentation

2.2.2 底物浓度对发酵的影响

通常采用增加底物的方法，获得较高的丁醇产量，提高丁醇生产的经济性.但随着底物的增加，会造成有害抑制物的积累等一系列问题［8］.因此寻找适宜的底物浓度显得尤为必要.试验对底物浓度研究条件如下:温度37℃，纤维素酶用量30 IU/g，接种量7%，基础培养基，发酵时间72 h.考察不同底物浓度对发酵的影响，结果如图2所示.由图可知，当底物质量分数为15%时，丁醇浓度最高.

图2 底物浓度对发酵的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on fermentiaon

2.2.3 纤维素酶用量对发酵的影响

在丁醇发酵过程中，酶的水解对丁醇的生成有决定性的作用.在温度37℃，底物浓度15%，接种量7%，基础培养基，发酵时间72 h的试验条件下，不同纤维素酶用量对发酵的影响如图3所示.图中结果表明，在纤维素酶用量25～40 IU/g的范围内，丁醇浓度随酶用量的增加而增加.较低的纤维素酶用量，不能有效的将秸秆酶解转化为还原糖，不利于后续的发酵;而较高的纤维素酶用量会增加生产成本.因此，选用30 IU/g为较优的纤维素酶用量.

图3 纤维素酶用量对发酵的影响Fig.3 Effect of loading of cellulose on fermentation

2.2.4 菌种接种量对发酵的影响

在发酵过程中，接种量与菌种的生长速度和丁醇的产量密切相关.因此，在温度37℃、底物浓度15%、纤维素酶用量30 IU/g、基础培养基、发酵时间72 h的试验条件下，进一步考察接种量对发酵的影响，结果见图4.接种量为7%时，丁醇产量最高.而接种量过高或过低，都会造成丁醇浓度明显下降.所以确定7%为最佳接种量.

2.2.5 培养基组成对发酵的影响

发酵培养基的组成对菌体的生长代谢和溶剂的生成有重要的影响.因此笔者重点考察了酵母抽提物(A)，KH2PO4(B)，MgSO4·7H2O(C)，(NH4)2SO4(D)，FeSO4·7H2O(E)，尿素(F)和CaCO3(G)7种营养物组成对丁醇浓度的影响.试验条件为:温度37℃、底物浓度15%、纤维素酶用量30 IU/g、接种量7%、发酵时间72 h.试验采用L32(74)正交试验进行培养基的优化，优化试验及结果见表2.

由表2的数据可以得到，优化培养基组成为:KH2PO40.8 g/L，MgSO4· 7H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，尿素3 g/L，CaCO38 g/L.

进一步和丁醇浓度最高的28号试验进行验证试验，结果如表3所示.

由表2和表3的结果，可得到较优的培养基组合为:酵母抽提物 1 g/L，KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，尿素2 g/L.在此条件下，发酵的丁醇浓度为9.37 g/L.

图4 接种量对发酵的影响Fig.4 Effect of inoculums on fermentation

2.2.6 发酵时间对发酵的影响

发酵时间直接影响丁醇生产的效率.在温度37℃，底物浓度15%，纤维素酶用量30 IU/g，接种量7%，优化的培养基的条件下，不同发酵时间对发酵的影响结果见图5.

图5 发酵时间对发酵的影响Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation

表2 培养优化的正交试验表Tab.2 Results of orthogonal experiment

试验结果表明，当发酵时间达到48 h时，丁醇浓度已基本趋于平稳.因此，可以选择48 h为较优的发酵时间，此时的丁醇含量为9.42 g/L.

表3 两种培养基对发酵的影响Tab.3 Effects of two kinds of medium on fermentation

3 结论

(1)笔者通过对不同糖化发酵丁醇试验结果的比较，得到糖化工艺Ⅴ，即首先加入纤维素酶量的1/3，反应24 h后，再加入1/3纤维素酶，剩下的纤维素酶再隔12 h加入，共糖化48 h是一条较佳的工艺路线.

(2)在糖化工艺Ⅴ的基础上，通过对丁醇发酵工艺中8个影响因素的考察研究，得到了在温度37℃，底物浓度15%，纤维素酶用量30 IU/g，接种量7%，优化的培养基组成:酵母抽提物1 g/L、KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，尿素2 g/L，发酵周期为48h的条件下，丁醇浓度达到9.42 g/L.

(3)试验表明汽爆玉米秸秆糖化发酵丁醇，取得了较好的发酵效果，为进一步的放大试验提供参考.

［1］WU M，WANG M，LIU J，et al.Assessment of potential life-cycle energy and greenhouse gas emission effects from using corn-based butanol as a transportation fuel［J］.Biotechnology Progress，2008，24(6):1204-1214.

［2］QURESHI N，SAHA B C，DIEN B，et al.Production of butanol(a biofuel)from agricultural residues:Part I-Use of barley straw hydrolysate［J］.Biomass and Bioenergy，2010，34(4):559-565.

［3］李冬敏，陈洪章.汽爆秸秆膜循环酶解耦合丙酮丁醇发酵［J］.过程工程学报，2007，7(6):1212-1216.

［4］陈守文，马昕，汪履绥，等.稻草酶法水解液的丙酮丁醇发酵［J］.工业微生物，1998，28(4):30-34.

［5］常春.生物质制备新型平台化合物乙酰丙酸的研究［D］.杭州:浙江大学材料与化学工程学院，2006.

［6］中国食品发酵工业研究院，北京宁馨儿生物科技开发有限公司，诺维信(中国)生物技术有限公司，等.QB 2583—2003附录A(规范性附录)滤纸酶活力(FPA)的测定方法［S］.北京:中国轻工业出版社，2003.

［7］刘广慧，朱文众，胡铁功.毛细管气相色谱法分析丙酮和丁醇发酵产物［J］.食品与发酵工业，2007，33(11):115-117.

［8］EZEJI T，QURESHI N，BLASCHEK H P.Butanol production from agricultural residues:Impact of degradation products on Clostridium beijerinckii growth and butanol fermentation［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97(6):1460-1469.