大豆根瘤菌与磷细菌混合培养下的互作效应

韩 梅，王慧达，李晓旭，王 卓，魏 冉

(沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳 110866)

磷是植物生长的三大营养元素之一，并且只有可溶性磷能被植物吸收利用。由于在自然条件下磷极易被固定，这极大限制了作物的正常生长。氮和磷是植物生长的重要元素，许多种类微生物对氮、磷等养分的转化和供给起重要作用［1］。根瘤菌能够固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养，解磷菌能够将植物难以吸收利用的磷转化为可溶状态，供植物吸收利用［2］。在自然界中微生物是以混居状态存在的，对于它们之间相互关系的了解有助于人类有意识地充分发挥其互作效应，但由于微生物存在个体微小的特点，对于在共存或混合状态下相互之间的关系的研究显得较为薄弱。多菌株混合培养时各菌之间存在着代谢的协同作用［3］。各菌之间可能进行直接或间接地相互作用，互相提供所需的营养，转移或消除抑制产物，或通过一些物理或生化机制刺激彼此间的生理活动［4］。本文通过对实验室保存的根瘤菌(R12)和解磷菌(S7)进行单独培养和混合培养，研究它们之间的互作效应，为复合微生物肥料的开发利用提供科学根据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 大豆根瘤菌R12、磷细菌S7，由沈阳农业大学微生物学教研室微生物肥料研究组分离和保藏。

1.1.2 培养基 根瘤菌采用YMA培养基;解磷菌采用牛肉膏蛋白胨培养基;解磷量的测定采用Pikovaskaia，s(PKO)培养基［5］;液体混合培养基:甘露醇10.0 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO40.5 g，酵母膏 1.0 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，FeSO40.003 g，Rh 溶液 4 mL，CaCO35.0 g，CaCl 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.8 ～ 7.0。(Rh 微量元素液:H3BO45.0 g，Na2MO45.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 3.0)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 将活化好的R12和S7菌种接入100 mL液体混合培养基，每瓶接入菌种2环，3次重复，30℃，150 r/min摇床振荡培养24 h，待用。

1.2.2 2菌单独培养及混合培养 将R12和S7各取2 mL分别接入100 mL PKO培养基，将R12和S7 2菌各取2 mL菌悬液混合接入100 mL PKO培养基，3次重复，并设一不接菌的空白对照，30℃，150 r/min摇床振荡培养，定时取发酵液。

1.2.3 单独培养后的除菌上清液制备 取菌悬液离心 10 000 r/min，20 min。

1.2.4 加入另一菌株单独培养后的除菌上清液培养 取单独培养后的除菌上清液2 mL加入已接入另一种菌的PKO液体培养基中培养，3次重复，并作一不接菌的空白对照，30℃，150 r/min摇床振荡培养，定时取发酵液。

1.2.5 生物量测定 采用稀释平板计数。

1.2.6 可溶性磷 采用钼锑抗比色法测定。

2 结果与分析

2.1 R12和S7混合培养的活菌数

对R12和S7分别进行单独及混合培养，在混合培养的初始阶段，R12与S7活菌数大致相等，培养24 h后，R12逐渐成为混合体系中的优势菌种，培养36 h，两者分别占总数的91.3%和8.7%。与单独培养相比，S7活菌数变化幅度较小，R12的数量变化幅度较大，明显多于单独培养(图1)。

2.2 S7对R12生长的影响

R12与S7混合接种和加S7单独培养后的除菌上清液混合培养与其单独培养相比，R12均提前进入对数期，单独培养在第48 h活菌数达到最大值，而在与S7混合培养和加S7单独培养后的除菌上清液条件下在36 h就达到了最大值，活菌数达到最大值均提前12 h;在对数期与单独培养相比较，混合培养活菌数高出38.2%，加S7单独培养后的除菌上清液高出45.8%。与混合培养相比，R12在加S7单独培养后的除菌上清液的活菌数增幅更为明显，比混合培养高出12.3%(图1)。R12混合培养和加S7单独培养后的除菌上清液比单独培养的活菌数表现出明显的增加。

2.3 R12对S7生长的影响

S7在单独培养，混合培养，加R12单独培养后的除菌上清液的条件下，活菌数变化不大，都在第60 h达到最大值，加入R12单独培养后的除菌上清液的处理比单独培养和混合培养的活菌数增加了7.5%和12.1%。单独培养比混合培养活菌数高出5%。可能是由于R12的生长繁殖消耗和占据了一定的营养和空间，使得S7的生长繁殖受到一定的限制，而比只加R12无菌单独培养后的除菌上清液的情况下少。

2.4 R12对S7解磷能力的影响

由图2可以看出，不同时期，混合培养和加入R12无菌单独培养后的除菌上清液2个处理都比S7单独培养时的解磷量高，3个处理都在第10天达到最大值，说明S7在第10天的解磷能力最强，混合培养和加入R12无菌单独培养后的除菌上清液较单独培养时的解磷量分别增加了23.6%和27.8%，且加入R12无菌单独培养后的除菌上清液较混合培养高5.6%。培养到第15天时，各个处理的溶磷能力开始下降，但是在第22天时，有所回升。这可能是发酵液中菌体的死亡率增加，细胞破裂，又将细胞内可溶性磷释放出来，导致发酵液中可溶性磷的浓度增加。

图1 S7、R12单独培养、混合培养及加彼此上清液的活菌数对比Fig.1 The contrast of viable count of S7and R12 cultured alone respectly、mixed cultured and witheach other＇Sterile supernatant

图2 不同处理条件下S7的解磷量对比Fig.2 The contrast of solubilizing of S7 under different conditions

3 讨论

研究结果表明，在混合培养中，R12和S7，与单独培养相比，两者的生物量都有不同程度的提高。原因可能是二者的某些代谢产物对彼此有一些促进作用。从试验结果推测，R12与S7可能存在互利共生关系，二者混合培养时可能进行直接或间接地相互作用，互相提供所需的营养，转移或消除抑制产物，或通过一些物理或生化机制刺激彼此间的生理活动。

在加入S7单独培养后的除菌上清液的处理中，R12的生物量表现为比单独培养和混合培养多。这说明在加入的S7单独培养后的除菌上清液对R12有一定的促进作用。进而说明S7生长繁殖过程中分泌的某些代谢产物对R12的生长繁殖有促进作用，而加S7单独培养后的除菌上清液比混合培养多的原因可能是混合培养下S7的生长过程需要占用一部分营养和空间，使得R12在混合培养条件下比加S7单独培养后的除菌上清液条件下活菌数偏少。在加入R12单独培养后的除菌上清液处理中S7的生物量也比单独培养和混合培养多。这说明加入R12的单独培养后的除菌上清液对S7有一定的促进作用。同样说明R12的代谢产物对S7也有促进作用。

在对解磷能力的研究中，本试验不同处理的条件下可溶性磷的浓度都在第10天达到最大值，说明这时的解磷能力最强。王富明等［6］研究表明，磷细菌和固氮菌联合生长时，对发挥磷细菌的解磷作用十分有利，有助于土壤中水溶性磷的形成。试验表明混合培养和加无菌单独培养后的除菌上清液都比单独培养表现出较强的解磷能力。在解磷能力达到最强时，混合培养和加入单独培养后的除菌上清液的S7生物量和单独培养相比没有太大变化，但是发酵液中的水溶性磷的浓度却比单独培养高，说明S7单菌的解磷能力提高了。原因可能是混合培养和加入单独培养后的除菌上清液的发酵液中某些代谢物质促进了解磷菌的解磷作用。同时磷是微生物生长繁殖的必需营养元素之一，混合培养过程中，将消耗一部分可溶性磷构建微生物细胞［7］，所以解磷菌的解磷能力可能更高。

［1］ 孙焱鑫，姚军刑，礼军.解钾菌与解磷菌及固氮菌的相互作用［J］.生态学杂志，2001，21(2):71-73.

［2］ 王光华，赵英，周德瑞，等.解磷菌的研究现状与展望［J］.生态环境，2003，12(1):96.

［3］ 丘元盛，周淑萍，莫小真，等.稻根联合固氮菌的研究Ⅰ:菌种的分离［J］.微生物学报，1981，21(4):468-472.

［4］ Holguin G，Bashan Y.Nitrogen fixing by Azospirillum brasilense Cd is provided when co-culture with a mangrove rhizosphere bacteria［J］.Soil Biol.Biochem，1996，28(12):1651-1660.

［5］ 冯瑞章，姚拓，周万海，等.溶磷菌和固氮菌溶解磷矿粉时的互作效应［J］.生态学报，2006，26(8):2764-2769.

［6］ 王富明，张彦，吴皓琼.解磷固氮菌剂的研制及其对小麦增产效应［J］.生物技术，1994，4(4):15-18.

［7］ 林启美，王华，赵小蓉，等.一些细菌和真菌的解磷能力及其机理初探［J］.微生物学通报，2001，28(2):26-30.