端粒酶活性对SGC7901胃癌细胞活性的影响

盖磊 宁显忠

胃癌严重威胁着人类的健康，但发病机制不清，仍无有效治疗手段。端粒-端粒酶体系在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，端粒酶的激活导致了端粒的延长，而端粒的延长则促进了肿瘤的永生化，但仍有10%的肿瘤细胞端粒酶无活性增高表现［1］。叠氮脱氧胸苷(3-azido-deoxythymidine，AZT)可抑制端粒酶活性，进而阻止端粒的延长，从而抑制肿瘤的永生化。因此，本实验拟利用AZT探讨端粒酶活性对胃癌细胞株SGC7901存活率的影响，探讨端粒-端粒酶体系在SGC7901细胞增殖分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 SGC7901胃癌细胞株(中科院上海细胞库)，DMEM高糖培养基及胎牛血清(Gibco公司)，AZT(sigma公司)，甲基噻唑基四唑(MTT，南京建成生物工程研究所)，TRAP-ELISA端粒酶活性试剂盒(Roche公司)，酶标仪(北京普郎克公司)。

1.2 实验分组 SGC7901细胞株以1×104/孔的密度铺于96孔板，细胞贴壁后分组培养，对照组(MDEM培养基+10%胎牛血清)，AZT-4、AZT-8及 AZT-16组分别添加 AZT 4、8及16 mmol/L，通过MTT实验确定AZT抑制SGC7901细胞增殖的最佳浓度及时间，再利用TRAP-ELISA法检测该条件下AZT对SGC7901细胞端粒酶活性的影响。

1.3 MTT法检测SGC7901细胞存活率 分组培养24 h、48 h及72 h后，以无血清培养基继续培养4 h，每孔分别加入20 μl MTT(5 mg/ml)，孵育 4 h后弃去培养液，加入 150 μl二甲基亚砜振荡15 min，以酶标仪检测吸光度(A值)，根据公式计算细胞活力:检测组A值/对照组A值×100%。

1.4 TRAP-ELISA法检测端粒酶活性 根据MTT实验结果，检测最佳抑制时间各组SGC7901细胞端粒酶活性。收集细胞，根据试剂盒说明建立 PCR反应体系，以 Ct值(cycle threshold)判断端粒酶活性值，Ct值小表示模板数大，端粒酶活性高，根据公式计算端粒酶活性下调率=(实验组平均Ct值-对照组平均Ct值)/对照组平均Ct值×100%。

2 结果

2.1 AZT对SGC7901细胞活力的影响 MTT实验显示，AZT可抑制SGC7901细胞活力，具有明显的时间依赖性及剂量依赖性，其中AZT作用72 h对SGC7901细胞存活率影响最为显著，因此本研究检测了72 h后各组细胞端粒酶活性(表1)。

2.2 AZT对SGC7901端粒酶活性的影响 TRAP-ELISA法检测显示，AZT浓度越高，SGC7901细胞端粒酶活性越低(表2)。

表1 AZT对SGC7901细胞活力的影响(n=6/组)

表2 AZT对SGC7901细胞端粒酶活性的影响(n=6/组)

3 讨论

端粒-端粒酶体系与肿瘤的增殖关系密切，该体系的激活具有促进肿瘤细胞增殖的作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸-蛋白复合体，可防止染色体DNA降解、缺失、末端融合以及非常规重组等，具有维持染色体结构和功能的完整性及稳定性等作用，与肿瘤的发生及凋亡密切相关［2］。端粒酶是一种核酸蛋白酶，属逆转录酶，能以自身的RNA为模板合成端粒DNA序列，使端粒延长，是维持端粒稳定的重要因素。端粒酶激活、端粒延长与肿瘤的发生关系密切，端粒酶活性高的肿瘤细胞易发生耐药性［3］，抑制端粒-端粒酶活性已成为抑制肿瘤增殖的研究的热点。

AZT是逆转录酶抑制剂，可与端粒酶这一逆转录酶结合，抑制端粒酶活性。本研究显示，不同浓度AZT均可抑制SGC7901细胞端粒酶活性，并明显抑制肿瘤细胞增殖，且AZT浓度越高，端粒酶活性越低，细胞存活率越低，提示端粒酶-端粒体系的活化是SGC7901细胞增殖的重要机制之一。尽管目前针对端粒酶的抑癌治疗策略尚不完善，对机体的毒副作用尚不完全清楚，尚难用于临床治疗。但随着对端粒-端粒酶在胃癌发病中研究的深入，端粒-端粒酶体系有望成为胃癌治疗新的突破口。

［1］Theimer CA，Feigon J.Structure and function of telomerase RNA.Curr Opin Struct Biol，2006，16(3):307-318.

［2］Matsutani N，Yokozaki H，Tahara E，et al.Expression of telomeric repeat binding factor 1 and 2 and TRF1-interacting nuclear protein 2 in human gastric carcinomas.Int J Oncol，2001，19(3):507-512.

［3］Guan JZ，Guan WP，Maeda T，et al.Different levels of hypoxia regulate telomere length and telomerase activity.Aging Clin Exp Res，2012，24(3):213-217.